Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

モノアラガイ / 味覚嫌悪学習 / インスリン / 飢餓 / 満腹 / 長期記憶 / 学習 / 記憶 / グルコース / 学習記憶

モノアラガイは味覚嫌悪学習を施すとインスリン様ぺプチド遺伝子の転写発現が亢進していることが、われわれの先行研究からすでにわかっていた。そこで、単離したモノアラガイの脳に、インスリン様ぺプチドを投与したところ、味覚嫌悪学習の基盤となる神経シナプスにおいて「長期増強」が観察された。さらにはモノアラガイ個体においても、脳内インスリン濃度が学習成績を決めていることが明らかとなった。そして最終的には、栄養状態と学習成績との関係を見出すことができた。

学習 / 記憶 / 環状アデノシン一リン酸 / cAMP / 単一細胞 / 学習記憶 / モノアラガイ

学習時にシナプス前細胞内でcAMP濃度が上昇するものと仮定されている。しかし、実際にcAMP濃度が上昇するのかは、これまでわかっていないかったで、モノアラガイ単一神経細胞を用いて検証することを目的とした。測定方法としては、cAMPセンサータンパク質によるイメージング法ならびにcAMPの抗体による超高感度ELISA法を用いた。イメージング法は残念ながら成功しなかった。一方、ELISA法については細胞内のcAMP濃度は10^-18 mol/cellくらいが定量できれば十分なはずであることがわかり、実際に今回のチャンピオンデータとしては、単一ニューロンでのcAMPは可能であることがわかった。

学習 / 記憶 / CREB / 単一細胞解析 / in situハイブリダイゼーション / 免疫組織化学 / qRT-PCR / モノアラガイ / C / EBP / mRNA / 味覚嫌悪学習 / スプライシング / NO合成酵素 / 長期促通 / アンチセンス・オリゴヌクレオチド

本研究では,脳の構造は簡単ではあるが複雑な学習を修得できる軟体動物腹足類のヨーロッパモノアラガイ(Lymnaea stagnalis)を用い,その味覚嫌悪学習の機構を例にとって,脳の階層性を確実に反映した学習・記憶機構の理解に努めることを目的とした.研究代表者らは,ヨーロッパモノアラガイの味覚嫌悪学習の鍵を握るキー・ニューロン(Cerebral Giant Cell)を同定することができた.そして,脳の階層性をトップダウンで降りてくることによって,長期記憶形成時にこのキー・ニューロン内では,cyclic AMP respohsive element binding protein 1(CREB1)の活性化が起こっていることもわかった.そこで,モノアラガイのCREBをクローニングし,in situハイブリダイゼーション法ならびに免疫組織化学法によって,それらが局在するニューロンを同定した.上述のキー・ニューロンにおいてもCREB1およびCREB2のmRNAの存在が確認された.以上の結果から,モノアラガイを用いることによって,一連の階層性に正確に沿ったボトムアップ法での解析が可能となることも示すことができた.代表研究者の講座において,定量real-time RT-PCR装置が導入され,この装置のお陰で,単一神経細胞内のCREB mRNAが定量解析できるようになった.そこでキー・ニューロン一つを単離して,CREBのmRNAコピー数を測ったところ,CREB2のmRNAが数百コピー存在することを示すことができた.この結果は,学習・記憶に伴う遺伝子発現量変化を,たった一つのニューロン内で定量測定する道を拓いたものと言える.

培養神経細胞 / 学習 / 情報伝達効率 / in vitro / ヨーロッパモノアラガイ / 大脳皮質 / 原子間力顕微鏡 / 膜電位光学測定 / 微細構造 / モノアラガイ / 中枢神経系 / 単一細胞 / フォトダイオードアレイ

1 培養神経細胞系でのin vitro学習系の確立
本年度は,ヨーロッパモノアラガイ中枢神経系から単離した神経細胞,ラット大脳皮質から単離した神経細胞,およびニューロブラストーマ・グリオーマの雑種細胞であるNG108-15細胞を各々用いて,神経ネットワークを作製し,それぞれの系の中の2つの神経細胞に着目して,刺激・記録を行う実験方法を確立した。そして上記の培養方法のうち大脳皮質を用いた場合にのみ,促通現象が得られることが分った。この結果は,大脳皮質の初代培養系がin vitro系での学習モデルとして大いに利用できることを示している。現在は,基板電極上で細胞を培養し,ガラス電極などを挿入することなしに刺激・記録できる方法を模索している。
2 培養神経細胞の3次元極微細構造観察
上記1での培養系のうち,モノアラガイ神経細胞の終末ならびにシナプス部位での無刺激下における自発的な極微細構造の経時変化を,原子間力顕微鏡によって観察することに成功した(研究発表の項を参照)。1で報告したように,次年度に基板培養法が確立すれば,原子間力顕微鏡観察と同時にin vitro学習実験が行えるようになり,まさに学習時の極微細形態変化をリアルタイムで観察出来るようになる。
3 フォトダイオードアレイを用いた単一神経細胞の膜電位光学測定
上記1で示した培養系を,膜電位感受性色素で染色して,単一神経細胞の膜電位測定を試みた。しかし残念ながら今年度はこの点を成功できないで終わった。しかし,染色や顕微鏡回りの各種の最適条件がかなり分かり始めて来ているので,次年度は成功できると確信している。

【研究分担者】
松尾亮太	福岡女子大学	国際文理学部	准教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
講内毅	浜松ホトニクス株式会社	システム事業部	開発研究員
榊原学	東海大学	開発工学部	教授	(Kakenデータベース)