【研究領域課題番号】20K06538 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

卵成熟誘起ホルモン / 1-methyladenine / 1-メチルアデニン / 受容体 / GPCR / ケミカルジェネティクス / シグナル伝達 / イトマキヒトデ / 卵成熟

【研究成果の概要】

ヒトデ卵成熟誘起ホルモンの受容体の同定が本研究の目的であり、昨年に引き続き、申請者がこれまでに見いだした有力候補であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)が真の受容体であるかどうかを確かめるための解析を行った。細胞内の候補GPCRの機能阻害を期待して、昨年度に引き続き抗体による阻害を試すとともに、新たに機能不全型GPCR変異体を作成して競合的阻害実験を試した。
抗体による阻害については、細胞内突出部分を抗原とした抗体を細胞内に直接注射しただけでは阻害効果を得られなかったため、本年度は、抗体をGPCRが局在する細胞膜部分へ運搬・濃縮するための機能タンパク質のmRNAをあらかじめ細胞に注射することで、わずかであるがコントロール抗体に比べて卵成熟を阻害する結果が得られた。明確な差が出なかったため、膜へ運搬・濃縮する作用を蛍光標識抗体と混合して検証したところ膜への集積は見られたものの多くは細胞質にとどまっていた。引き続き他の膜局在化シグナルも試している。阻害用の抗体については、他に４種類のペプチド抗体を作成しており、そのうち１種類は全く効果がなかったが、他の３種類については、細胞膜の外側の領域を抗原としているため、培養液に添加して阻害実験を実施するために必要な精製濃縮抗体の準備を進めた。予備実験では効果が見られなかったため、より抗体が反応しやすくなるようにFab断片化抗体の調製を進めている。
抗体以外の阻害実験として、GPCRの機能に重要な働きを担うC末テール部分の一部を欠損させた変異体をいくつか作成した。そのうちのひとつは、変異を入れていないGPCRを発現させた時と比べて、卵成熟誘起ホルモンへの応答性にわずかではあるが差が見られた。発現させたGPCRが正しく膜に局在化したかを確認するため、N末細胞外領域に挿入したTag抗体を用いて関節免疫蛍光染色を行い膜局在化を確認した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】16K07344 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / 血管内皮細胞 / 腎蔵 / シグナル伝達 / 糸球体 / 細胞内情報伝達 / ノックアウトマウス / 血管内皮 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

本研究では,まず,Gpr116が腎糸球体の血管内皮細胞に局在することを免疫電顕で明らかにした。次に，正常マウスとGpr116欠損マウスの糸球体血管内皮細胞の遺伝子比較解析を行い，Gpr116欠損によって変動する遺伝子を同定した。また，Gpr116の細胞内シグナル伝達経路については，Gpr116の過剰発現によって活性化状態に変化する細胞内シグナル伝達分子の候補の絞り込みができた。さらに，Gpr116安定発現細胞株を用いてせん断ずり応力（shear stress）への応答性について検討したところ，流れ刺激によってわずかであるが応答を示すことを見出した。

【研究の社会的意義】

腎炎や腎不全に有効な治療法が確立しておらず，年々透析患者数が増加する傾向にあって患者の医療費負担や国の財政圧迫が国内外問わず問題視されている。その為，糸球体濾過障壁の形成維持機構の解明が急務となっている。本研究は，糸球体血管内皮における情報伝達とその作用という新しい切り口から 濾過障壁の恒常性維持機構の解明に挑戦する点が特色であり，今まで不明な点が多かった糸球体内皮細胞の特性を明らかにするばかりでなく，腎疾患の病態の基礎・臨床研究の進展に貢献できる点で意義深い。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】15K14473 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖因子 / チロシンキナーゼ / 受容体 / サイトカイン / 増殖因子受容体 / シグナル伝達 / 増殖因子 / ペプチド / HGF / MET / 特殊環状ペプチド

【研究成果の概要】

細胞増殖因子受容体をダイマー化する人工リガンド技術は再生医療に応用可能であるとともに、従来にない生物活性をもつ人工リガンドを創成できる可能性が考えられる。本研究は、異なる受容体同士を人為的にダイマー化することで、ヘテロ受容体のシグナル活性化につながるかを検討した。ダイマー形成の評価系としてsplit luciferase系と原子間力顕微鏡による解析系を確立した。一方、MET受容体、RET受容体、IGF受容体についてヘテロダイマー形成を誘導したが、シグナル活性化は認められなかった。増殖因子受容体の新たな組合せを検討し、ヘテロ受容体活性化人工リガンド創成の可能性を検討することが必要と考えられた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】基礎獣医学・基礎畜産学

【研究領域課題番号】24380161 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

繁殖生物学 / プロラクチン / 選択的スプライシング / シグナル伝達 / 性周期 / 獣医学 / 生理学 / 畜産学 / 遺伝学 / 受容体 / 乳腺 / 遺伝子

【研究成果の概要】

成熟雌ラットの性周期各時期に卵巣を摘出し、プロラクチン受容体ロングフォーム、ショートフォームについてリアルタイムPCRおよびウェスタンブロットを行ったところ、黄体退行の始まる時期である発情休止期の午後に、ロングフォームとショートフォームの発現比率がRNA・タンパクレベルで逆転した。そこでロングフォームの発現のみを抑制するスプライシング切替オリゴマーを持続的に投与し、血中性ステロイド濃度の測定を行ったところ、薬剤用量依存的に発情休止期の延長がみられた。以上より、ロングフォームが黄体の機能、および寿命の決定に中心的な関わりをもつことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】18,330千円 (直接経費: 14,100千円、間接経費: 4,230千円)

【研究分野】形態・構造

【研究領域課題番号】24657047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヒトデ / 卵成熟 / ホルモン / 受容体 / GPCR / ナノアフィニティービーズ / 1-メチルアデニン / シグナル伝達

【研究成果の概要】

ヒトデ卵成熟誘起ホルモンのシグナル経路の全容解明を目指し、特にシグナル経路の最上流にあって、今なお分子的実体が不明であるホルモン受容体の実体解明を目的として、新規材料であるナノアフィニティービーズを用いて受容体の単離・同定に挑戦した。結合蛋白として同定した３つの受容体候補蛋白はrendezvin遺伝子産物であり、翻訳後にfurinによるプロセシングを受け生成することを解明し、また、rendezvin自身はG蛋白共役型受容体(GPCR)ではなく新規のヒトデGPCRと結合して働く可能性を示した。受容体は、これまでに報告のないユニークな構造を持つ新規GPCR複合体と予測される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】生物生産化学・生物有機化学

【研究領域課題番号】21580125 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / ストレス / シグナル伝達 / ペプチド

【研究成果の概要】

受容体型キナーゼRPK1過剰発現植物が高い乾燥耐性および酸化ストレス耐性能を持つことを示した。RPK1は複合的なストレス環境など、自然の複雑な環境条件下での植物の適応反応に機能することが示唆された。さらに、システインリッチリピート(CRR)受容体型キナーゼCRK36が、植物の浸透圧ストレスおよびアブシジン酸応答を負に制御を行う新規因子であることを示した。CRK36は細胞質型キナーゼARCK1と受容体複合体を形成して下流のシグナル伝達を制御し、ストレス下における光合成の制御を行うことを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】薬理学一般

【研究領域課題番号】21229004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / チャネル / 輸送系 / シグナル情報伝達 / シグナル伝達 / 生体分子 / 脳・神経 / 薬理学 / 生理学

【研究成果の概要】

中枢神経系において、Ca2+シグナルの未知機能探索とシグナル分子可視化研究を介して中枢神経ネットワーク機能について以下の成果を得た。(1) アストロサイト細胞内Ca2+シグナルを介したアストログリオーシス機構および神経細胞保護作用を明らかにした。(2) グルタミン酸シグナルがどのような時空間分布をとって伝達を行っているかについて、直接的な解析に初めて成功した。生体脳内測定へと拡張し、感覚入力によりグルタミン酸スピルオーバーが起きることを証明した。(3) NOによるCa2+放出（NICR）を発見。小脳シナプス長期増強を惹起することとNOによる神経細胞死にNICRが関与し得ることを示した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2009-05-11 - 2014-03-31

【配分額】238,940千円 (直接経費: 183,800千円、間接経費: 55,140千円)

【研究分野】生物生産化学・生物有機化学

【研究領域課題番号】18380070 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ジベレリン / 受容体 / シグナル伝達 / 核内リセプター / 核内レセプター

【研究成果の概要】

モデル植物・シロイヌナズナを対象として、ジベレリン受容体3種(AtGID1a,1b,1c)の各翻訳産物を調製し、いずれもが活性型ジベレリン特異的な互いに似た結合様式を示すことを明らかにした。また、多重の機能欠失型変異を導入した植物体の解析から、AtGID1a,AtGID1cに関する2重変異体のみ、他の組み合わせによる2重変異体あるいは、各1遺伝子の機能欠失型変異体では認められない矮性の形質が現れることが明らかとなった。3種のGID1遺伝子の花茎における発現状況には極端に大きな差異が認められなかったことから、AtGID1a,AtGID1c2重変異体でのみ形質が現れる点について、(a)より微細なレベルで比較した場合には他の2種と異なる遺伝子発現パターンをAtGID1bが呈する可能性、(b)AtGID1bが花茎において潜在的に機能が低い可能性が考えられた。そこで酵母を用いて、ジベレリンのシグナルを負に調節するDELLA因子との相互作用状況、あるいは、DELLA因子の分解に関わるF-Boxタンパク質SLY1との相互作用状況に組み合わせいかんで差が認められるか調べた結果、組み合わせの如何に依らず(i)GA依存的にGID1-DELLA間の相互作用が生じること。(ii)SLY1の存在によりGID1-DELLAで形成されていた相互作用が消失することを確認した。従って、酵母を用いた実験系からは上記(b)の可能性を示唆する結果は得られなかった。しかしながら、AtGID1a,AtGID1c2重変異体においてAtGID1b遺伝子を過剰発現させた場合、ある程度までの背丈の回復が認められたものの、野生型植物体と同程度の丈までの回復は望めないことから機能面でAtGID1bが機能しづらい何らかの仕組みが存在することが強く示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】16,900千円 (直接経費: 15,100千円、間接経費: 1,800千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】18206083 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / 受容体 / 造血前駆細胞 / 増殖制御 / シグナル伝達 / がん治療 / 樹状前駆細胞 / ガン治療

【研究成果の概要】

樹状細胞は有能な抗原提示細胞であり、抗原特異的な細胞傷害性T細胞を効率良く活性化できることから、がん治療への応用が期待されている。しかし、樹状細胞を効率良く増幅する手法は未だ確立されていない。そこで本研究では、樹状細胞の源である造血幹細胞においてサイトカインや増殖因子とは全く異なる抗原に応答して増殖シグナルを伝達する人工受容体を発現させ、抗原添加によって造血幹細胞の増幅が可能であることを実証した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2006 - 2009

【配分額】49,660千円 (直接経費: 38,200千円、間接経費: 11,460千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】17780081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / GPCR / 遊離脂肪酸 / シグナル伝達 / GPR120 / アポトーシス / GLP-1 / MAPキナーゼ

【研究成果の概要】

遊離脂肪酸(Free Fatty Acid : FFA)は多くの組織において生理的に重要な役割を果たしている。FFA誘導体であるプロスタグランジンやロイコトリエンは細胞膜に特異的なGタンパク質共役型受容体(GPCR)を持つことから、FFA(特に長鎖)も細胞膜上に特異的な受容体を持ち、それを刺激することによって細胞内情報伝達に寄与している可能性があると考えられてきた。最近、いくつかのグループが3つのオーファン受容体GPR40,GPR41,GPR43がFFAによって活性化されることを報告した。申請者らはこれらのグループとは独立に新たな長鎖FFA受容体としてGPR120を同定し、さらに、GPR120が腸管においてインクレチンの一つであるGLP-1と分泌細胞(L細胞)において共存し、FFAによるGLP-1の分泌に関わっていることを証明した(Hirasawa et al.,Nature Medicine,2005)。本研究では、新規FFA受容体GPR120のシグナル伝達経路とその結果もたらされる生理現象の解明を目的として研究を行っている。昨年度は、マウス腸管由来STC-1細胞においてFFAによるERKの活性化が血清飢餓等によって起こされる細胞死(アポトーシス)を阻害することを下記らかにした。また、このFFAによるアポトーシス抑制作用が、GPR120を介するものであることを明らかにした(Katsuma et al.,Journal of Biological Chemistry,2005)。本年度は、他の動物種であるラットのGPR120オーソログをクローニングした(Acc#AB207868)。現在、その機能解析を行っているところである。また、昆虫等、他の生物種から脂肪酸受容体の同定を試みているが、現在のところ成功していない。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】14208087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 血管新生 / ES細胞 / BMP / 骨芽細胞 / シグナル伝達 / 受容体 / 細胞分化 / 血管内皮細胞 / 平滑筋細胞

【研究成果の概要】

1)マウスのES細胞はFlk-1陽性の血管前駆細胞に分化したあと、VEGFの作用の有無により、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞に分化する。血管内皮細胞と平滑筋細胞が共存する条件では潜在型TGF-βが効率良く活性化されることが知られている。この系においてTGF-βレセプターキナーゼの抑制剤であるSB-431542を添加したところ、血管内皮細胞の増殖とシート形成が著明に促進されることが明らかとなった。血管内皮細胞ではタイトジャンクションの形成に関わるclaudin-5の産生がSB-431542によって著明に上昇し、細胞と細胞の境界に集積している像が観察された。
2)我々は、マウス間葉系前駆細胞C2C12とヒト間葉系幹細胞をBMP4で骨芽細胞へ分化誘導する系において、BMP4が内因性のTGF-βの作用を活性化してSmad6の発現を誘導し、その結果、Smad6がBMP4による骨芽細胞分化を抑制することを見いだした。SB431542は内因性のTGF-βの作用を抑制し、Smad6の発現を抑制した結果、骨芽細胞分化をBMP4と協調的に促進した。この結果は、TGF-βシグナルを制御することによってBMPシグナルを増強する可能性を示唆し、骨・軟骨再生医療に応用できると考えられた。
3)我々はヒト微小血管内皮細胞(HMEC)とES細胞由来血管内皮細胞に対してBMP4がその増殖を強く促進し、アポトーシスを抑制することを明らかにした。BMP4の標的遺伝子を解析した結果、BMP4はId-1やVEGFR2、Tie-2の発現を亢進させ、さらにこれらの受容体のリン酸化を促進することが明らかとなり、BMP4による血管内皮細胞増殖促進作用はVEGF-A/VEGFR2とAngiopoietin-1/Tie-2シグナル伝達系を介していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2005

【配分額】53,170千円 (直接経費: 40,900千円、間接経費: 12,270千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】11480215 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / DNAマイクロアレイ / 浸潤 / 受容体 / Smad / 血管内皮細胞 / 転写調節 / 細胞分化 / 骨形成因子 / 骨芽細胞 / シグナル伝達 / 表皮角化細胞 / 血管新生

【研究成果の概要】

1.BMPによるC2C12細胞の骨芽細胞への分化にSmadがどのように関わっていくかを、アデノウィルスベクターによる発現系を用いて検討した。BMP処理を行った細胞で、ALP活性の上昇が認められるが、Smad1及びSmad5を過剰発現された細胞ではその活性が更に増強された。抑制型Smadを過剰発現させた細胞では、逆にALP活性の低下が認められた。C2C12細胞の骨芽細胞様分化誘導におけるBMP-4とBMP-6のシグナル経路を解析した。BMP-4は主にALK-3に結合してSmad1/5/8を活性化するのに対し、BMP-6はALK-2に結合しSmad1/5を活性化した。また、BMP-4とBMP-6の両者を加えることにより、いずれか一方よりも強力な分化誘導作用が見られた。
2.血管内皮細胞ではTGF-βのI型受容体であるALK-5に加えてALK-1が発現しており,それぞれが異なるR-Smadを活性化する。血管内皮細胞におけるTGF-βの標的遺伝子を明らかにする目的で,ヒト臍帯静脈血管内皮細胞に活性型のALK-1とALK-5をアデノウイルスベクターを用いて導入し,オリゴヌクレオチドマイクロアレイを行った。その結果、約7000の遺伝子の中からALK-1ではSTAT1、endoglin、Idファミリーの転写因子、Smad6、Smad7などが特異的に誘導されることがわかった。一方、ALK-5ではclaudin5の抑制が見られ、tight junctionの形成がALK-5で影響を受けることが考えられた。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞にALK-5を導入すると細胞の増殖抑制が見られ、一方ALK-1を導入するとin vitroでの細胞分化促進が見られたことから、DNAチップで得られた遺伝子が血管内皮細胞の増殖・分化に関与していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】生物生産化学・応用有機化学

【研究領域課題番号】09660121 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アブシジン酸 / ジベレリン / 受容体 / カルシウムチャンネル / 情報伝達 / ABCトランスポーター / 液胞 / 細胞膜 / 植物ホルモン / アリューロン細胞 / 蛍光標識 / シグナル伝達 / cGMP

【研究成果の概要】

大麦アリューロン細胞を用いて、植物ホルモンの受容体の解析と植物ホルモンの作用に阻害的に作用する化合物の合成及びその作用部位についての解析を、併せて開発したセルソーターを用いた植物ホルモン受容体解析手法を用いて行った。まず、植物ホルモンの受容体解析を目標としたビオチン標識化アブシジン酸の合成を4'位にスペーサーを導入することにより行った。この化合物はジベレリンにより誘導されるα-アミラーゼ合成の阻害活性及びアブシジン酸により誘導されるデヒドリンの誘導活性を示すというアブシジン酸と同様の活性を有していたことより、アブシジン酸受容体に作用していることが示唆された。続いてこのビオチン標識アプシジン酸とアリューロン細胞プロトプラストとの相互作用を、蛍光標識アピジンのビオチンへの親和性を利用して、フローサイトメーターを用いて解析した。その結果、アブシジン酸受容体が細胞膜上にあることも示すことができた。またこの解析法を用いることにより、ビオチン標識アブシジン酸結合部位(アプシジン酸受容体)に拮抗的に作用している可能性のある化合物を見出すことができた。さらにカルシウムチャンネル阻害剤のビオチン誘導体を合成し、植物ホルモンの場合と同様の解析を行い、カルシウムチャンネルが細胞膜上にあることも示すことができた。また蛍光標識アブシジン酸・ジベレリンを、アブシジン酸やジベレリンのモデル化合物として用いて、細胞内での局在について検討したところ、液胞へと輸送されることが明らかとなった。また単離した液胞を用いて検討したところ、液胞内への取り込みにはATPが必要であることから、いわゆるABCトランスポーターにより液胞内へと輸送される可能性が示された。
以上、標識化した植物ホルモン誘導体が植物ホルモンの作用部位や蓄積部位を調べる上で有用であることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09480199 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 骨形成因子 / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / 遺伝子ターゲッテイング / レセプター / アクチビン / アポトーシス

【研究成果の概要】

1. Tkv結合蛋白質クローニングとその哺乳類細胞での機能解析:ショウジョウバエのセリン-スレオニンキナーゼ型レセプターであるThick veins(Tkv)に結合する蛋白質をtwo-hybrid法で検索し、DIAP1(Drosophila apoptosis inhibitor-1)をクローニングした。
2. Smadのシグナル伝達機構における役割:我々はSmadファミリーの分子をその構造と働きから、特異型、共有型、抑制型の3種類に分類できることを明らかにした。また新しいSmad分子であるSmad6をクローニングした。Smad6は他のSmadの作用を抑制する抑制型Smadであることが明らかとなった。
3. 骨形成因子のシグナル伝達におけるSmadの役割と遺伝子導入による解析:アデノウイルスベクターに組み込んだSmad1やSmad5を骨芽細胞前駆細胞に導入してその作用を調べた。Smad1やSmad5は単独で細胞に感染させても骨芽細胞への分化誘導活性は低いが、低濃度のBMPや活性化型レセプターを加えると、作用の劇的な増強が見られた。
4. TGF-βシグナルに関与するSmad3の変異体の機能解析と腫瘍形成能:Smad3の407番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異を作り、その作用を検討した。変異型Smad3はTGF-βのシグナルを伝達しないだけでなく、優勢抑制型変異体として作用した。変異型Smad3を大量に発現している細胞ではTGF-βの増殖抑制作用に対し抵抗性になっていた。さらにこれらの細胞をコラーゲンゲルの上で3次元培養するとコラーゲンゲルの中に細胞が浸潤していく像が見られた。
5. シグナル伝達分子の遺伝子ターゲッテイング:BMPレセプターII型遺伝子およびSmad2のターゲッテイングを行った。いずれも発生初期の段階で致死的であった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】15,100千円 (直接経費: 15,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】08458233 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / アクチビン / 骨形成因子 / レセプター / シグナル伝達 / セリン・スレオニンキナーゼ / 血管新生 / 皮膚角化細胞 / セリン-スレオニン・キナーゼ

【研究成果の概要】

1.GDF-5のレセブターの同定:我々はBMPファミリーに属する新しい因子GDF-5(growth/differentiation factor-5)のレセブターとの結合と機能解析を行った。GDF-5は2種類のBMPのI型レセプター(BMPR-IAとBMPR-IB)のうちBMPR-IBにのみ特異的に高い親和性で結合することが明らかになり、他のBMPファミリーとの特性の違いが明らかとなった。
2.GDF-5の血管新生作用:我々はBMP-2やGDF-5の血管新生作用を検討し、TGF-βやアクチピンと比較した。その結果、in vivoのアッセイ(CAMアッセイやウサギの角膜アッセイ)でGDF-5に血管新生作用があることが確認されたが、BMP-2には血管新生作用はなかった。血管新生のメカニズムを明らかにするためにウシ大動脈由来の培養血管内皮細胞に対するGDF-5の作用を調べた結果、内皮細胞の遊走やプラスミノーゲンアクチベータの産生を促進することが明らかになり、血管新生のメカニズムが明らかとなった。
3.皮膚におけるアクチピンの分化誘導作用:皮膚におけるアクチピンの細胞増殖・分化への作用を調べる目的で、ヒト皮膚組織の免疫組織化学的検討と培養角化細胞におけるその機能の検討を行った。正常ヒト皮膚組織や培養角化細胞HaCaTにおいてIB型レセブター(ActR-IB)、II型レセブターの発現が見られた。アクチピンAは培養角化細胞に作用し分化誘導作用を示したが増殖抑制作用は軽度であった。これに対しTGF-βは増殖を強く抑制するが、分化は誘導しなかった。シグナル伝達分子Smad2やSmad3のリン酸化にアクチピンとTGF-βで明らかな違いが見られ、アクチピンではSmad3により特異的な活性化が見られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996

【配分額】6,300千円 (直接経費: 6,300千円)

【研究分野】食品科学・製品科学

【研究領域課題番号】07456058 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Taste / Signal transduction / G protein / Receptor

【研究成果の概要】

本研究は、申請者自身が世界で初めて成功した味覚レセプターのクローニング[J.Biol Chem.,.268,12033-12039(1993)]を基盤に、共役するGTP結合タンパク質、エフェクター、第二メッセンジャー、イオンチャンネルの解析を通じ、外来情報の最初のしかも主要な受容部位である味細胞におけるシグナル変換からシナプス電流発生までの細胞内シグナル伝達のプロセスの分子レベルでの解明を目的として実施された。
味覚の(主として甘味と苦味)の第二メッセンジャーとしてcAMPとIP3を生成することがすでに知られているが、この際に関与するGタンパク質はGsα、GqαおよびGiBγ分子種であると考えられている。申請者が味細胞に存在するGタンパク質を検索したところ、Gqαタイプの分子種G15-likeをラット舌ライブラリーよりクローン化することができた。このタンパク質の発現は味細胞にも観察されたことから、味覚のシグナル伝達、特にIP3の生成に関与しているものと推定している。またrサブユニットについてもその存在を検討してみたところ、舌に特異的ではないものの、新種の分子種のクローンを得ることができた。
得られたクローンを培養細胞(バキュロウィルスを用いたSf9細胞)を用いて発現させ、リガンド(各種味物質)による第二メッセンジャー(cAMPあるいはIP3)の濃度変化の測定を行ったところ、舌由来のクローンを発現させたものにおいて、とくにIP3の濃度について有為な差が観察された。各種味物質のうちでは苦味に対しての反応性が大きく、得られたクローンが苦味のシグナル伝達に関与している可能性が示唆された。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1995

【配分額】6,700千円 (直接経費: 6,700千円)

【研究分野】病体医化学

【研究領域課題番号】07557334 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / アポトーシス / セリン-スレオニン・キナーゼ / アクチビン / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)は細胞の増殖を抑制するほか多彩な作用をもった生理活性物質である。TGF-βは二種類のセリン-スレオニンキナーゼ型レセプター(I型、II型)によってシグナルを伝達し、細胞内ではSmadという蛋白質を介してシグナルを伝達する。本研究では以下のプロジェクトについて研究を行った。
1)TGF-βI、II型レセプターの種々の疾患における発現:網膜芽細胞腫や扁平上皮癌、前立腺癌などを中心にレセプターの発現と変異の有無を検討した。網膜芽細胞腫の培養細胞株ではII型レセプターの発現を認めないが、分化にともない発現が見られた。II型レセプターのプロモーター領域には変異は見られなかった。またI型レセプターにも異常があることが示唆されたが、Smadには異常は見られなかった。前立腺癌でもI、II型レセプターの発現の低下を認めた。
2)TGF-βレセプターの細胞内基質の同定とcDNAクローニング:酵母を用いたtwohybrid法により、ショウジョウバエのI型レセプターThick veinsの基質となるペプチドしてDIAP1(Drosophila inhibitor of apoptosis-1)をクローニングした。
3)シグナル伝達分子Smadの作用と疾患における異常の検討:TGF-βレセプターのシグナル伝達分子Smad2の異常を同定するため、遺伝子構造の決定を行った。さらにSmad2にはエクソン3が転写されないタイプのものが存在することを明かにした。エクソン3のないSmad2はこれをもつものよりも活性が高い可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】07457032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / リン酸化 / シグナル伝達 / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / 増殖抑制 / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

1. β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)のII型レセプターによるI型レセプターの活性化
TGF-βはまずII型レセプターに結合し、この結果I型レセプターをリン酸化して活性化するが、そのさいI型レセプターのGSドメインとよばれる構造が重要であることがこれまでに知られている。今回我々は、I型レセプターの膜貫通領域とGSドメインの間に位置する領域(以下、JM領域)のシグナル伝達における重要性を明らかにした。さらにII型レセプターとI型レセプターのリン酸化部位の同定を試み、II型レセプターでは膜貫通領域とキナーゼ活性領域の間に位置する領域とC末端領域が、またI型レセプターではJM領域とGS領域のセリンやスレオニンがリン酸化されることを確認した。今後はリン酸化によってどのようなシグナルが伝えられるかを明らかにする。
2. TGF-βI型レセプターの細胞内基質の同定とシグナル伝達機構
我々は酵母を用いたtwo-hybrid法によってTGF-βI型レセプターの基質となるペプチドのクローニングを試みた。その結果FKBP12(免疫抑制剤であるFK506やラパマイシンの細胞内結合ペプチド)やfarnesyl transferase-αを見出した。さらに最近ショウジョウバエ由来のI型レセプターであるthick veinsやsaxophoneに結合するタンパク質の同定をtwo-hybrid法で試みた。その結果、FKBP-12の他、少なくとも3つの新しいタンパク質が結合することが明らかとなった。今後はこれらのタンパク質のシグナル伝達における役割、とくに増殖抑制やアポトーシスへの効果を検索する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1995

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】05680618 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エリスロポエチン / 誘導遺伝子 / 受容体活性化 / プロモーター / 細胞増殖 / 分化 / シグナル伝達 / 受容体 / 情報伝達機構 / 活性化 / キメラ分子 / 分子生物学 / 細胞分化

【研究成果の概要】

我々はエリスロポエチン(EPO)受容体の活性化機構を解明する目的でチロシンキナーゼ型受容体(EGF受容体)の細胞外ドメインとEPO受容体細胞内ドメインのキメラ分子を作成しその機能を解析した。その結果キメラ分子はリガンド(EGF)に依存して2量体化し、細胞増殖および細胞分化(グロビンの合成)を誘導することがわかった。したがってエリスロポエチン受容体はリガンドに依存した2量体化によって活性化され、その細胞内ドメインに増殖分化のシグナルを発生するのに必要十分な機能がそなわっていることが明らかとなった。またEPO受容体の細胞内ドメインのC末端半分の約100アミノ酸残基を削ると、むしろ強く増殖や分化を誘導するようになった。したがって分化のシグナルに必須の領域はEPO受容体細胞内ドメインの膜に近い約120アミノ酸の範囲にあり、増殖のシグナルに必須の領域とオーバーラップしておりC末端半分はそれらのシグナルを負に調節していることになる。エリスロポエチン受容体からのシグナルによって誘導される遺伝子は細胞増殖や赤芽球分化を調節する重要な働きがあると考えられる。そこで我々はサブトラクション法を用いて、まずエリスロポエチン受容体によって誘導される遺伝子を複数クローニングした。今回SH2ドメインを有する新規遺伝子CIS(cytokine-inducible-SH2 protein)を発見しその機能解析を行った。誘導の分子機構を解析するためにプロモーター領域約1キロベースをクローニングした。今後転写活性化に必要なシスエレメントを同定し、そこに作用する転写因子を明らかにする。さらにCISは活性化されたEPO受容体やIL3受容体に会合することを明らかにした。今後CISを経由するシグナル伝達経路を明らかにし、またトランスジェニックマウスなどで生理機能を明らかにしたい。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】04454105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳腺 / レセプター / プロラクチン / インシュリン / MAPキナーゼ / 細胞増殖 / 成長因子 / 分化 / 乳腺上皮 / ホルモン / P34^<cdc2>キナーゼ / P32^<cdk2>キナーゼ / 分裂調節 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)