【研究領域課題番号】20H02160 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ナノポア / インピーダンス / ウイルス / バクテリア / ナノデバイス / センサ / 交流 / 機械学習 / 超微少電流 / 細菌1粒子センシング / ウイルス1粒子センシング / 感染回避 / 電気インピーダンス計測 / ナノ流体デバイス / 細菌1細胞解析 / ウイルス1粒子解析 / 電気インピーダンス / 誘電泳動 / ナノ電極 / ナノ流体システム / バイオセンサ / 細菌 / 感染症予防

【研究成果の概要】

これまでも度々問題になっていた現象であるが，バクテリア計測時はバッファである生理食塩水の塩濃度が高く導電率も高いため，高電界を印加すると電極エッジ部分に電界が集中して電極反応により電極が電気分解する問題が顕著になった。そこで電極の保護のため，デバイス形状の大幅な見直しを行った。具体的には，これまでのデザインとは逆に電極のエッジは使わずに電極面積をなるべく大きく使うように測定セルの形状を変更した。さらに電極間に仕切り板を設け，その中央部の一点のみに直径数100nmから数umの孔(ナノポア)を作製し，電極から出た電気力線をナノポア内に集中させることで高電場を生ぜしめ，ナノポア内のみを高電界の測定空間とする工夫をした。また，仕切り板部分の厚みが薄いと，この部分の電気容量が大きくなりカットオフ周波数が低下するため，膜部分は25umと比較的厚くすることでカットオフ周波数を10kHz以上に設定した。このデバイスを用いて高電界インピーダンス測定をしたところ，乳酸菌，大腸菌それぞれの単一バクテリア由来の信号を数100pAレベルで計測することに成功し，単一バクテリア計測の実証に成功した。さらに得られた電流波形に対して，k-近傍法，ロジスティック回帰，ベクトルサポートマシン，ランダムフォレストなどの基本的な機械学習アルゴリズム4種を適用してバクテリアの種類の同定性能を評価した。測定データはアンダーサンプリングにてデータ数を揃え，各学習モデルに対して5分割交差検証で評価した。その結果，最も良い正解率を出したのはランダムフォレストで，乳酸菌，大腸菌，ポリスチレン粒子の3種類からのそれぞれの粒子同定の正解率は87.7%に達した。以上，当初の実験計画の目標である，高電界インピーダンス測定法による単一バクテリア測定の実証，および機械学習を利用したバクテリアの同定を達成することができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究領域課題番号】20K10436 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マイクロバイオーム / 微生物 / 細菌 / ウイルス / 都市 / 人工環境 / 建造環境 / 抗生物質耐性 / 都市マイクロバイオーム / 人工環境の微生物 / メタゲノム / 薬剤耐性 / 新型コロナウイルス感染症（COVID-19） / MetaSUB国際コンソーシアム / バッチ効果 / 微生物群集 / オリンピック / 抗菌薬耐性 / プラスミド

【研究成果の概要】

微生物による感染症の増加要因には、抗菌薬耐性などの病原体要因に加え、都市化による人口の集中、交通機関の発達による人の国際的な移動などの社会的要因が関与している。感染症の国際化に対応するためには、感染症のアウトブレイク（パンデミック）が発生する前の状態を定期的に観測する国際協力体制の構築が必要である。これまでに、国際コンソーシアム MetaSUB (Metagenomics & Metadesign of Subways & Urban Biomes; metasub.org) では、標準化されたプロトコルを用いて、都市のマイクロバイオーム urban microbiome（微生物群集とその遺伝子の総体）の共通点と相違点を明らかにしてきた。しかし、人の国際的な移動イベントに伴う都市マイクロバイオームの変動を調査した研究は前例がない。2020年は、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）パンデミックにより、国外からの来訪者が激減し、「緊急事態宣言」に伴い学校施設などが閉鎖された。そこで、本研究では、COVID-19パンデミック下の国際イベント（オリンピック・パラリンピック）開催前後の都市マイクロバイオーム（ウイルス・細菌・薬剤耐性遺伝子の組成）の変動を明らかにすることを目的とする。
2021年度は、東京2020オリンピック（7月23日-8月8日）・パラリンピック（8月24日-9月5日）開催期間中とその前後に定期的に、建造環境 built environment（鉄道の駅、学校施設など）表面からサンプルを採取した。サンプルは米国ニューヨーク市（Mason Lab, Weill Cornell Medicine）へドライアイス輸送した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】19KK0242 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

コウモリ / 疫学解析 / ウイルス / 細菌 / 寄生虫 / 遺伝子 / 抗体 / 疫学調査 / リスク分析 / 網羅的解析 / 病理解析 / 感染症 / 疫学 / 数理モデル

【研究成果の概要】

コロナウイルスやエボラウイルス、ニパウイルスなど、世界的に問題となっているウイルスの自然宿主としてコウモリは知られている。今後も、コウモリから新たなウイルス感染症が発生する可能性は否定できない。また、コウモリを介した細菌や寄生虫の拡散リスクについては情報が少ない。コロナウイルスについては、SARS-CoV-2関連ウイルスが日本を含む東南アジアに生息するコウモリから検出されていることから、令和3年度はコロナウイルスを中心に調査を行った。
フィリピンのルソン島北部にあるビアクナバト国立公園で捕獲されたコウモリ9種120匹から採取した血液、小腸及び腸管スワブを対象にリアルタイムPCR法及びRT-PCRによりコロナウイルスのゲノム検出を行うと共に、ELISAを用いてSARS-CoV-2特異的抗体の検出を試みた。リアルタイムPCRの対象領域はN領域、RT-PCRの対象領域にはORF1a、ORF1b、S 領域を設定し、N領域はSARS-CoV-2検出用リアルタイムPCR、ORF1a及びS領域はSARS-CoV-2検出用nested PCR、ORF1b領域はコロナウイルスを広く検出可能なconventional PCRを行った。
小腸サンプルを対象としたリアルタイムPCRでは3サンプルで陽性が確認されたが、RT-PCRでは遺伝子の増幅が確認されなかった。糞便サンプルについては、ORF1b及びS領域を対象としたPCRでは遺伝子の増幅は確認されなかったが、ORF1a領域を対象としたPCRでは120サンプル中52サンプルで遺伝子増幅が認められ、そのうち43サンプルで塩基配列が決定され、SARS-CoV-2と98%以上の相同性を示した。SARS-CoV-2特異的抗体は検出されなかった。今後、生態情報を含めた疫学解析を行い、コロナウイルスを保有するコウモリの特徴について明らかにしていく。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

【研究期間】2019-10-07 - 2023-03-31

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)

【研究領域課題番号】18H01842 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マイクロ流路 / SEM / 電子線透過膜 / 液中細菌 / 極薄電子線透過膜付きマイクロ流路 / 誘電泳動 / 細菌 / ウイルス / マイクロ流路技術 / バイオフィルム / MEMS寒天セル / 光ピンセット / 壁なし流路 / 開放型マイクロ流路 / 精密位置決め技術 / 細菌観察 / 電子顕微鏡 / 極博化 / 粗微動ステージ駆動機構 / 寒天マイクロ流路 / 液体セル

【研究成果の概要】

耐性菌の増加が懸念される中、耐性菌の新規治療方法の開発が遅れている。そこで、これまでバイオ分野であまり注目されていなかった無機元素の観点から、液中細菌を高分解能観察するための技術を開発した。高分解能で電子顕微鏡観察するための薄膜技術や細菌搬送技術を開発し、液中細菌の高分解能観察を実現した。これにより数百nm級の構造やウイルスの観察も可能となった。さらに、細菌の無機元素の検出にも成功した。

【研究の社会的意義】

本研究では、液中細菌やウイルスの高分解能観察と無機元素分析を可能とした。これにより、これまで得られなかった細菌の生命現象に関する知見や細菌とウイルスの相互作用を高分解能で観察できるようになる。これらの知見は、耐性菌の新規治療方法の開発に大いに役立つと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究領域課題番号】18K09316 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

咽頭癌 / ウィルス / 細菌 / microbiomr / Fusobacterium / 頭頸部癌 / HPV / Microbiome / 唾液検体 / 頭頚部腫瘍 / 遺伝子解析 / エピゲノム解析

【研究成果の概要】

HPV-HNSCC全ゲノムデータを用いて新しいプライマー/プローブセットを設計した。設計されたセットは、CaSki 細胞株DNAを用いてスクリーニングし、HPV-HNSCC患者の咽頭うがい液サンプルで確認した。結果、HPV-16ゲノムのうち、 E5領域とL2領域の間で最もリード数が多く、E1領域に普遍的に存在する領域が存在した。CLIA認定の実験室環境において、2つのセットとE7セットの組み合わせにより、咽頭うがい液サンプルにおいて感度は96％（27/28）、特異度は100％(0/15)だった。結論：HPV-HNSCCにおけるHPV-16 DNA検出能を改善できた。

【研究の社会的意義】

HPV関連中咽頭癌は現在増加傾向を有するウィルス関連癌である。本癌に対する前がん病変は明確ではないため、今後嗽液や血液からのリキッドバイオプシーによる発がんリスク分類が必要となってくる領域である。本研究ではその発がんリスク分類を明らかにするために既存のゲノム情報からより検出感度を高めるプライマー/プローベセットを開発することに成功した。本研究をもとにこれまで困難であったHPV関連中咽頭癌の早期発見を可能にする基盤を作成したと考える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】環境動態解析

【研究領域課題番号】15H01725 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

海洋 / 微生物 / 凝集体 / 炭素循環 / 沈降フラックス / 中・深層 / ウィルス / 微生物群集 / 細菌 / 珪藻類 / 海洋炭素循環 / 微生物ゲノム / 細菌群集 / 有機物

【研究成果の概要】

海洋表層の基礎生産で生成された有機物（凝集体）の沈降によって媒介される炭素鉛直輸送（生物ポンプ）は、海洋内部での炭素貯留を促進するプロセスとして重要であるが、その変動や制御には不明の点が多い。本研究では、凝集体の形成・沈降過程を、凝集体と海洋細菌群集の相互作用という新たな切り口から追及した。実験的解析の結果、海洋細菌群集には、大型凝集体の形成を顕著に促進する作用があることが示された。また、凝集体形成促進能を持つ細菌グループとしてシュードアルテロモナス属を特定した。海洋観測研究では、凝集体の大深度分布や、炭素の鉛直・水平輸送において果たす役割についての解明を進め、成果を論文として公表した。

【研究の社会的意義】

今後、海水温の上昇や気候変動による海流の変化が起きたときに、生物ポンプの機能がどのように変化するのかを予測することは人類にとっての重大な関心事である。本研究の成果は、気候変動に対する海洋炭素循環システムの応答とそれが気候に及ぼすフィードバックを考えるうえで重要な基礎的知見である。また、凝集体は、海洋における汚染物質（放射性物質やマイクロプラスチックなど）の分布や動態にも強い影響を及ぼすことから、本研究の成果は、新しい海洋環境浄化手法の開発といった応用的な分野にも重要なヒントを与える可能性がある。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】45,500千円 (直接経費: 35,000千円、間接経費: 10,500千円)

【研究分野】環境リスク制御・評価

【研究領域課題番号】26550081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ウイルス / PCR / 不活化 / 誤陽性 / 消毒 / 細菌 / RNA分解

【研究成果の概要】

PCR法ではウイルスの感染性の有無について判定できない。本研究では、PCR法の前処理として、感染性のあるウイルスを選択的に残す手法の開発を行った。様々な菌株を用い、RNAの分解を試みたが、短時間で99%以上のRNA分解（RT-PCRによる定量ベース）を達成することが困難であることが分かった。そこで、細菌処理に代わり、がん治療等で遺伝子に働く治療薬としても用いられているプラチナに着目し、研究を行った。cis-DDPを用いた方法はウイルスの不活化を評価するために効果的な方法であることが分かった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】獣医学

【研究領域課題番号】25304043 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翼手目 / ウイルス / フィリピン / 国際研究者交流 / 感染症 / 細菌 / 原虫 / 疫学 / 動物 / 環境

【研究成果の概要】

翼手目（コウモリ類）は生物学的多様性とその分布・移動域の広さ、巨大なコロニー形成などの特徴をもつ特異な生物である。また、エボラウイルスなどの高病原性病原体の自然宿主と疑われており、病原体レゼルボアとして高いリスクをもつ。本研究はフィリピンにおいて翼手目の保有病原体の疫学調査を実施し、翼手目の人獣共通感染症のレゼルボアとしての評価を行うことを目的とした。
ミンダナオ島、ルソン島中央部、ルソン島北西部においてそれぞれ捕獲調査を行い、合計266匹の翼手目を採取した。これらのサンプルより新規のレオウイルス、ハンタウイルスを見出し、さらに病原性細菌や原虫を保有していることも明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】17,030千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 3,930千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】24590574 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自然免疫 / シグナル伝達 / サイトカイン / 核酸 / ノックアウトマウス / 自然免疫系 / 核酸認識受容体 / 感染 / ウイルス / 細菌 / 病原体

【研究成果の概要】

ウイルスや細菌などの感染に際し、病原体由来核酸は自然免疫受容体によって認識され、免疫応答を強く活性化する。この応答は感染防御に必須であり、その詳細を明らかにすることは重要である。我々は、病原体由来核酸を模した核酸アナログと結合する分子（NAS1及びNAS2）を同定した。これらの分子についてコンディショナルノックアウトマウスを作製し、NAS1が核酸による刺激時のI型IFNやIL-12p40の産生に関与することを明らかにした。また、NAS1欠損マウスではヘルペスウイルス感染、リステリア感染時の生存率が顕著に低下する。本研究から、NAS1は感染防御に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】環境動態解析

【研究領域課題番号】22651004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

海洋 / 微生物 / ウィルス / 空間分布 / 生態系 / 鉛直分布 / 細菌 / シアノバクテリア / 海洋生態系 / 紫外線 / 溶存酸素

【研究成果の概要】

外洋域においてウィルス数が局所的極大を示す層、すなわち「ウィルス・ホットスポット(VHS)」、の分布の実態把握と形成機構の究明を行った。観測の結果、VHSは中部および西部北太平洋において広範に見られ、その分布が溶存酸素アノマリーの分布と関連することが明らかになった。観測・実験データを基に、VHSの形成には、宿主依存的なウィルス生産、鉛直混合、紫外線影響の3要因が関与しているという新たな仮説を提案した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,550千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 450千円)