【研究分野】人体病理学

【研究領域課題番号】17590317 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / 網膜症 / 血液網膜関門 / 低酸素 / claudin-5

【研究成果の概要】

糖尿病網膜症における血液網膜関門機能の破綻機序について、誘因として組織低酸素状態に注目するとともに、中枢神経系の血管内皮細胞間tight junctionを構成する分子であるclaudin-5の関与に焦点をあて解析を進めた。正常酸素濃度環境下のin vitro bEND.3細胞(マウス脳血管内皮細胞株)およびin vivoマウス網膜血管内皮細胞において細胞膜に限局した発現を示すclaudin-5が、低酸素濃度環境下〔1%O_2下24時間培養(in vitro);7-9%O_2下7日間飼育(in vivo)〕では細胞膜から消失するという興味深い知見を得た。そして、その低酸素状態でのclaudin-5発現変化が、in vitro系においてはbEND.3細胞層の電気抵抗値、in vivo系においては網膜血管の低分子量分子に対する透過性亢進と相関することが示され、低酸素状態がclaudin-5を標的として血液網膜関門機能を破綻させることが強く示唆された。続いて、この低酸素状態でのclaudin-5発現変化の分子機構の詳細につきin vitro系にて解析を行った。その結果、正常酸素濃度環境下に比して低酸素濃度環境下のbEND.3細胞ではclaudin-5蛋白質レベルが有意に低下するのに対し、claudin-5 mRNAレベルには有意な変化がみられないことが示された。さらに、種々の細胞内蛋白質の分解に関与するユビキチン-プロテアソーム系の阻害剤であるMG-132を用い解析を行ったところ、低酸素状態でのbEND.3細胞膜からのclaudin-5分子の消失が、MG-132の存在下では抑制され、低酸素状態におけるclaudin-5の発現変化にユビキチン-プロテアソーム系が関与する可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】医療系薬学

【研究領域課題番号】15390046 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血液網膜関門 / vitamin C / GLUT1 / 酸化的ストレス / 抗酸化物質 / 糖尿病 / TR-iBRB細胞 / 輸送機構 / 担体輸送 / 条件的不死化細胞株

【研究成果の概要】

抗酸化物質であるvitamin C (ascorbic acid, AA)の網膜への供給機構解明は、網膜の酸化的ストレス保護、さらに網膜疾患の予防および治療において重要である。本研究は、酸化型vitamin C (dehydroascorbic acid, DHAA)の網膜移行性を血液網膜関門(BRB)に存在するヘキソース輸送担体であるGLUT1が担っていることを証明すること、GLUT1におけるDHAAの輸送機構を解明すること、さらに糖尿病状態におけるDHAAの網膜への輸送能の変動について解明することを目的とした。BRB輸送解析は^<14>CでラベルしたAAおよびDHAAを用いて解析した。Integration plot法を用いた血液から網膜への移行性解析から、[^<14>C]DHAAは[^<14>C]AAと比較して38倍高いBRBを介した透過クリアランス値を示した。高速液体クロマトグラフィー解析から、網膜に取り込まれたDHAAは主にAAに変換されて存在することが示唆された。内側血液網膜関門のin vitroモデルとして用いたTR-iBRB細胞における輸送機能解析から、TR-iBRB細胞における[^<14>C]DHAA取り込みはNa^+非依存性、濃度依存性(Km=93μM)を示した。さらに、[^<14>C]DHAA取り込みは促進輸送型ヘキソース輸送担体(GLUT)の基質であるD-glucose、3-0-methyl-D-glucoseおよび2-deoxyglucoseや阻害剤であるphloretinおよびcytochalasin Bによって強く阻害された。D-Glucoseによる[^<14>C]DHAAの取り込み阻害定数(IC_<50>)は5.6mMであった。磁気ビーズ抗体を応用した網膜毛細血管内皮細胞高純度単離法を開発し、網膜毛細血管内皮細胞における発現遺伝子の定量を可能とした。Ex vivoラット網膜毛細血管内皮細胞には、GLUT family中でGLUT1が高く発現し、DHAAの網膜への輸送には主な役割を担っていることが明らかとなった。Streptozotoc-inを投与して作製した糖尿病モデルラットにおける[^<14>C]DHAAの網膜への透過クリアランスは、血中D-glucoseの上昇に伴い、コントロールに比べて31%低下した。以上の結果から、網膜へのvitamin Cの供給はBRBに発現しているGLUT1を介してDHAAとして輸送されることが明らかとなった。さらに、糖尿病時にはGLUT1の基質であるD-glucose濃度が上昇することから、網膜へのDHAA輸送能が低下し、網膜内へのvitamin C供給が減少する可能性が示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】13,200千円 (直接経費: 13,200千円)