【研究領域課題番号】21H04752 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現リプログラミング / 1細胞期胚 / 未受精卵 / ヒストン変異体 / リプログラミング / 遺伝子発現 / クロマチン構造

【研究成果の概要】

受精前後において、分化した卵から全能性を持つ受精卵へと変化するが、その際に大規模なクロマチン構造の変化を伴う遺伝子発現のリプログラミングが起こる。一方、クロマチンを構成するコアヒストンおよびリンカーヒストンには様々な変異体が存在し、それらがクロマチン構造および遺伝子発現の調節に大きく関わっていることが知られている。そこで本研究では、ヒストン変異体に着目し、遺伝子発現リプログラミングを調節するメカニズムの解明を目指す。
本年度は、受精前後におけるヒストン変異体の置換とクロマチン構造の変化との関連を明らかにすることを目的とした。これまでの研究では、ヒストン変異体のゲノム上の配置については、ChIPやCUT＆RUNによる解析が行われてきているが、これらは単に配置を調べるだけで、クロマチン構造との関連は明らかにできない。そこで、塩析を行った後にCUT＆RUNを行うことでこれらの関連を解析する手法を考案した。すなわち、塩析によるヌクレオソームからのヒストンの離脱を指標としたクロマチン構造の解析とCUT&RUNによる配置の解析を複合させた手法である。
そこでまず予備段階として、EGFPを結合させたH2Bを1、2細胞期胚に取り込ませ、塩濃度を変化させてそのクロマチンからの乖離を調べたところ、クロマチン構造が緩んでいる1細胞期胚では、2細胞期胚と比較して低い塩濃度から乖離が始まっていた。また、H3変異体の特異抗体による免疫染色での検出では、変異体間で乖離が起こる塩濃度に違いが見られた。さらにH3変異体に依存するヒストン修飾に関しても、それらの間で乖離度に違いがあった。しかし、まだ乖離が始まる前の低い塩濃度で処理した際に、未処理のものよりもH3変異体や修飾のシグナルが増加するという現象が見られ、これらは解析の精度に悪影響をもたらすものと考えられ、その改善が必要と考えられた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2021-04-05 - 2024-03-31

【配分額】42,250千円 (直接経費: 32,500千円、間接経費: 9,750千円)

【研究領域課題番号】18H03970 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現リプログラミング / ヒストン変異体 / 初期胚 / 卵 / クロマチン構造 / リプログラミング / 着床前初期胚 / 遺伝子発現のリプログラミング / ヒストンH3変異体 / 1細胞期胚 / 初期発生 / 遺伝子発現

【研究成果の概要】

受精前後において遺伝子発現リプログラミングが起こるが、本研究ではヒストン変異体の動態に着目し、そのメカニズムの解明を目指した。
研究の成果として、受精直後のマウス１細胞期胚において、H3変異体においてはH3.1/H3.2が極端に少なく、ほぼH3.3のみがクロマチンに存在し、またH2A変異体についてはH2A.XとTH2Aのみが多く存在していることが明らかとなった。ノックダウン/アウトおよび過剰発現によって、遺伝子発現およびクロマチン構造の変化が確認されたことから、これらがリプログラミングに関与していることが示唆された。

【研究の社会的意義】

現在、クローン動物やiPS細胞の作製成功により、リプログラミングについて高い関心が寄せられている。しかし、これまでのところ、受精前後におけるリプログラミングについては、その調節機構を調べた研究は極めて少ない。本研究により、リプログラミングの調節機構が明らかになることで、発生あるいは細胞分化を人為的に支配する途が新たに開けることが期待される。また、現在のところiPS細胞およびクローン動物作成の成功率が低いが、これはゲノムのリプログラミングが正常に進行していないことがその主な原因と考えられる。したがって、本研究の成果は効率的なiPS細胞およびクローン動物の作成法に新たな途を開くものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】44,330千円 (直接経費: 34,100千円、間接経費: 10,230千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】17380166 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

卵 / 初期胚 / 遺伝子発現 / リプログラミング / ヒストン / ヒストン修飾 / 発生 / 受精 / 減数分裂

【研究成果の概要】

本研究では、受精前後における遺伝子発現リプログラミング機構の解明のため、次のような研究ステップを計画した。
1.リアルタイムに発現している遺伝子プロファイルの作成
2.転写制御機構の解析-転写因子・エピジェネティックな修飾
3.RNAiによる機能解析
以下にこの計画に沿った研究成果の概略を記す。
1.1細胞期胚にBrUTPを導入し、一定時間内にこれを取り込んだmRNAを抗BrU抗体で単離した後、これをマイクロアレイによって解析することで、1細胞期胚における遺伝子発現プロファイルを明らかにすることを試みた。その結果、1細胞期で発現している50以上の遺伝子を明らかにした。これらの遺伝子の制御領域を解析した結果、PaxおよびEts familyに属する転写因子が結合する配列を持つものが多数存在することが明らかとなった。
2.まず、1500の転写因子を載せたマイクロアレイを用いて、成長卵および初期胚での転写因子の発現を調べた。その結果、転写因子の発現パターンは1細胞期から2細胞期にかけて最も大きく変化していた。さらに成長卵から
2細胞期胚にかけてTATA-lessのプロモーターを活性化するEts familyに属する転写因子群の発現増加が顕著に見られた。次に、成長期卵と受精後の初期発生期胚について、様々なエピジェネテック調節に関わるヒストン修飾を調べた。その結果、卵が成長する過程において、調べたすべてのヒストン修飾が増加していた。また、受精後においては、着床期前初期発生過程で様々な修飾が大きく変化していることが明らかとなった。
3.成長中の卵にRNAiを顕微注入し、in vitroでGV期卵にまで成長させ、その後め減数分裂、および初期発生への影響を調べるための実験系の確立を試み、本実験系が効果的に機能することを確認した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】14,120千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】14360164 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現 / リプログラミング / 初期化 / 初期胚 / 減数分裂 / 核移植 / クローン動物 / ヒストンアセチル化 / 遺伝子発現リプログラミング / 未受精卵 / ヒストン脱アセチル化酵素 / マウス

【研究成果の概要】

受精前後における遺伝子発現プログラムの初期化機構を解明する目的で研究を行った。まず初期化の機構について、「初期化には、cell memoryの消去が必要である」との仮説を立て、この仮説の検証を行い、さらにcell memoryを消去する機構の解明を行うこととした。
そこで、cell memoryのマーカーとして近年注目を集めているヒストンのアセチル化について調べた。体細胞、および受精後の初期胚の体細胞分裂期における様々なヒストンのリジン残基のアセチル化状態についてそれぞれの特異抗体を用いて免疫染色法により調べた結果、体細胞およびすべての発生段階の胚においてほとんどのリジン残基が分裂期においてもアセチル化されたままであり、これらがcell memoryのマーカーとして機能しているという仮説を支持するものであった。続いて、減数分裂中の卵におけるヒストンのアセチル化状態を調べた。GV卵では調べたすべてのリジン残基がアセチル化されていたものが、減数分裂に入るとすぐにすべてのアセチル化が消失し、第2減数分裂中期まで脱アセチル化されたままであった。さらに、体細胞核を未受精卵に移植することにより遺伝子発現のリプログラミングが起こることが知られているため、移植後に凝集した染色体におけるヒストンアセチル化状態を調べたところ、上記のすべてのリジン残基においてアセチル化が消失していた。
以上により、減数分裂特異的なヒストンの広範な脱アセチル化が、受精前の遺伝子発現の初期化機構に関与していることが示唆された。
さらに、この減数分裂期特異的なヒストンの脱アセチル化は、脱アセチル化酵素がこの時期特異的に染色体に結合できることによることを示し、その調節にp34^<cdc2>が関与していることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】14,800千円 (直接経費: 14,800千円)