【研究領域課題番号】21H02410 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 薬学 / 生物物理 / 蛋白質

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2025-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究領域課題番号】20K21473 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 薬学 / 生物物理 / 蛋白質

【研究成果の概要】

(1) モデルタンパク質を用いた安定同位体標識条件の最適化
前年度に引き続き、膜タンパク質などの核磁気共鳴（NMR）解析においてボトルネックとなっている、安定同位体標識技術の開発をおこなった。前年度までに緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現量を指標に、培地に添加するアミノ酸や血清などの添加物の量、タイミングの検討を進めてきた。本年度は、モデルタンパク質として20種類のアミノ酸を含むチオレドキシン（Trx）を用いて、各アミノ酸残基の標識率を算出した。添加する標識アミノ酸の種類や量について検討した結果、14種類のアミノ酸残基について、部分重水素化を達成することに成功した。代表的な膜タンパク質であるGタンパク質共役型受容体（GPCR）について考えると、重水素化できた14種類のアミノ酸残基の水素原子は、膜貫通領域の水素原子の75%に相当する。このことから、本手法はGPCRをはじめとする様々な膜タンパク質のNMR解析に適用可能であると結論した。
(2) 開発した安定同位体標識法の膜タンパク質への適用
(1)で開発した安定同位体標識法が、実際の膜タンパク質のNMR解析に有用であることを実証するため、GPCRの一種であるβ2アドレナリン受容体について、安定同位体標識およびNMR解析をおこなった。その結果、これまでに申請者が確立済みである昆虫細胞を用いた標識条件と同様に、高感度かつ高分解能なNMR解析が可能であることがわかった。一方で、新たに開発した標識法は、昆虫細胞での発現量が少ない膜タンパク質にも適用可能であることから、これまでNMR解析が困難であった多くの創薬標的にもその適用範囲を拡大できるものであると考えた。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2020-07-30 - 2023-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】19H03164 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自然免疫 / TLR受容体 / クライオ電子顕微鏡 / タンパク質 / 構造解析 / シグナル伝達 / 膜受容体

【研究成果の概要】

自然免疫受容体のTLR全長に関して構造生物学的研究を進めた。TLR3全長をナノディスクに再構成した試料についてクライオ電子顕微鏡構造解析に成功した。細胞外ドメインの密度は明瞭に観察されたが、膜貫通領域および細胞内のTIRドメインは解像されなかった。核酸認識TLRの局在を制御するUNC93B1とTLR3およびTLR7の複合体の構造解析に成功し、UNC93B1による核酸認識TLRの局在制御機構の構造基盤を明らかにした。

【研究の社会的意義】

種々の病気の治療薬開発のターゲットであるTLR受容体に関して構造生物学的な研究を進めた。TLR全長の活性化機構の全貌はいまだ明らかになっておらず、本研究は今後の研究の基盤となることが期待される。一部のTLRの細胞内局在を制御するUNC93B1とTLRの複合体の構造解析に成功し、TLRの細胞内局在を制御する薬剤開発の構造基盤を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】17K07448 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 転写制御 / 分子認識 / GRASファミリー / 結晶構造解析 / IDDファミリー / 転写因子 / タンパク質間相互作用 / パターン形成 / 蛋白質 / 生体分子 / シグナル伝達 / 植物 / 発現制御

【研究成果の概要】

植物の根の形態形成に関与するGRASファミリーと転写因子IDDファミリーの相互作用に着目して、構造生物学的・生化学的手法を用いてより詳細な転写制御の分子機構の解析を行った。GRASファミリーのSCL3とIDDファミリー複合体のX線結晶構造解析を行った結果、既存のGRAS-IDD相互作用とは異なる新規の相互作用であることが明らかとなった。また、生化学的な解析から転写因子IDDファミリーとGRASタンパク質の組み合わせによって多数のタンパク質から構成される複合体が形成され、複雑な転写制御が行われている可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

植物の根の形態形成は成長過程と調和して転写制御をオン・オフにするため、複雑に制御されている。本研究では根の形態形成に重要な2つのファミリーGRAS, IDDファミリーについてその立体構造解析と分子相互作用解析の結果から、GRASファミリーとIDDファミリーの相互作用様式には多様性があることを示し、結合する組み合わせによって様々な転写制御複合体を形成し得ることを明らかにした。本成果は植物の複雑な転写制御機構の理解を深めると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】17H04999 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核磁気共鳴法 / シグナル伝達 / 膜タンパク質 / Gタンパク質共役型受容体 / 脂質二重膜 / 薬学 / 生物物理 / 蛋白質 / 免疫学 / 構造生物学

【研究成果の概要】

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は、様々な細胞外からの刺激に応答する膜タンパク質であり、感覚受容・神経伝達など、様々な生理機能に関与している。本研究では、タンパク質の動的な性質を原子レベルで観測可能な核磁気共鳴（NMR）法を用いて、GPCRの一種であるβ2アドレナリン受容体およびアデノシンA2A受容体の解析をおこなった。これにより、β2アドレナリン受容体が化合物依存的に、多様なシグナルを細胞内に伝える機構、および脂質二重膜の組成依存的にアデノシンA2A受容体の活性が変化する機構を解明した。

【研究の社会的意義】

医薬品の30%以上は、G蛋白質共役型受容体（GPCR）に作用して、シグナル伝達活性を変化させることで、治療効果を発揮する。本研究で得られたGPCRの構造を参考にして、下流のシグナルを伝達する分子との相互作用に、選択的に作用する化合物を作ることができれば、副作用を抑制する薬剤を、合理的に設計できる可能性が示された。また、脂質の作用を模倣することで、生体内に存在する化合物や他の薬剤がすでに結合したGPCRに対しても作用する薬剤設計の道が開け、新たな作用点および薬理作用を持つ医薬品の開発が加速することが期待される。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】26,130千円 (直接経費: 20,100千円、間接経費: 6,030千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】17K07329 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 蛋白質間相互作用 / 蛋白質工学 / 酸化ストレス / 細胞保護 / 生体分子 / シグナル伝達 / ストレス

【研究成果の概要】

ヒト脳神経細胞内に存在するニューログロビン(Ngb)は、酸化ストレスに伴う神経細胞死を防ぎ、また、通常酸素濃度正常状態では神経突起伸長を促す。本研究では、我々は、蛋白質工学的手法を用いて、ヒトNgbの作用機序の解明、及び、蛋白質間相互作用に着目した機能制御機構の解明に挑んだ。その結果、Ngbの働きに重要なアミノ酸残基や蛋白質間相互作用に重要なアミノ酸残基を明らかにできた。さらに、今回、新たに、Ngbと相互作用する蛋白質を発見することもできた。

【研究の社会的意義】

本研究により、脳卒中、脳梗塞など酸化ストレスに伴う神経細胞死を防ぎ、さらに神経再生を促す蛋白質であるニューログロビン(Ngb)の作用メカニズムがより詳細に明らかになった。また、Ngbが関わる蛋白質―蛋白質間相互作用についてもアミノ酸レベルで理解できるようになった。これらの研究成果は、脳卒中や脳梗塞のみならず、酸化ストレスに伴う他の疾患である癌、心筋梗塞、神経変性疾患などの治療薬開発にも役立つものと期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】17H03975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオ医薬 / 抗体医薬 / 安定性 / 凝集 / タンパク質 / 界面 / 免疫原性 / 分析 / バイオ医薬品 / 蛋白質 / 凝集体 / 質量分析 / 立体構造 / 抗体 / 免疫複合体 / TNF / 超遠心分析 / 沈降速度法 / 生体分子 / 薬学 / シグナル伝達 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

本研究によりバイオ医薬品で発生するタンパク質凝集体の定量的解析手法が確立し、凝集の原因となるストレスの特定に成功し、さらに凝集体の免疫原性との関連性について解明することができた。とくに、プレフィルドシリンジに塗布されたシリコンオイルとタンパク質が複合体となった際の免疫原性への影響は顕著であり、製剤における容器設計の重要性がより明確となった。また、従来から提唱されてきた、コロイド安定性と構造安定性に加えて、界面安定性の向上が凝集体発生の抑制には需要であることを示すことができた。さらに今回見出した振動や衝撃がタンパク質凝集を引き起こす点も医薬品の安定性を高める上で非常に有益であるといえる。

【研究の社会的意義】

本研究は、近年、利用されているバイオ医薬品の安定性と安全性に関するものであるが、これまで不明点が多かったタンパク質凝集体と副作用の関係を実験的に示唆することができた社会的意義の大きい研究成果である。特に、製薬企業から医療現場で利用される実際の場面へとフィードバックが可能な知見が数多く含まれており、かつ、応急処置的な対応では無く、包括的かつ根本的に医薬品の安定性を高めることが可能となることから、科学的意義は当然ながら、産業的意義が大きいといえる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,380千円 (直接経費: 12,600千円、間接経費: 3,780千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】16H04781 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RhoGTPase / PKC / PP2A / 酵母 / Rho1 / Pkc1 / GAP / シグナル伝達 / Rho GTPase / ストレス応答 / 細胞周期制御 / 癌 / 菌類 / 蛋白質 / 老化 / 細胞 / GTPase

【研究成果の概要】

出芽酵母Rho1GTPaseはヒト発がん遺伝子RhoAの相同遺伝子でストレス応答時にはPKCを介したMAPキナーゼ経路の活性化を、栄養増殖時にはPP2Aを介した細胞壁合成を促進することが知られている。しかしRho1がどのようにしてPKCとPP2Aという２種類の異なる標的を使い分けているのかは謎であった。本研究では①Rho1-PKC経路とRho1-PP2A経路はそれぞれポジティブフィードバックによって安定化すること及び②PKCとPP2Aがお互いに阻害しあうことを明らかにした。これらの結果はRho1下流の二つの経路がどちらか一方のみしか活性化できないことをうまく説明することができる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】16H06380 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物 / 有性生殖 / 自家不和合性 / 自他識別 / シグナル伝達 / 進化 / 植物生化学 / 生殖 / 蛋白質

【研究成果の概要】

自家不和合性の自他識別に関わる花粉因子および雌蕊因子の立体構造と相互作用様式をタンパク質レベルで解明し、アブラナ科植物における自己認識およびナス科植物における非自己認識の実態を明らかにした。アブラナ科植物が特異なCa2+シグナル経路を使って不和合反応を誘起していること、ナス科植物が細胞毒として機能する雌蕊因子の非自己特異的分解を介して他家受精を可能にしていることを明らかにした。植物の多様な自家不和合性機構の獲得に環境変化等に応じた可逆的な自家和合化が関与したとする新たな進化モデルを提唱した。

【研究の社会的意義】

自己・非自己の識別は、生物の根幹を成す基本的性質である。また、自家不和合性は、植物が種の遺伝的多様性を獲得する上で不可欠の性質である。一方で、氷河期など植物が孤立する環境下では自家不和合性は生存にとって不利に働く。本研究は、自家不和合性の仕組みとその可塑性を明らかにし、植物が多様な性表現を獲得し繁栄してきた経緯の理解を目指すものである。持続可能な地球環境維持に向けて重要な基礎的視点を提供すると共に、新たな植物育種法の確立など農業面への応用展開も期待できる研究である。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2016-05-31 - 2021-03-31

【配分額】183,040千円 (直接経費: 140,800千円、間接経費: 42,240千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】16H02545 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物 / シグナル伝達 / 細胞間認識 / 生殖 / 自家不和合性 / アブラナ科 / ナス科 / バラ科 / 蛋白質

【研究成果の概要】

アブラナ科およびナス科・バラ科植物の自家不和合性の分子機構解明に向けて、以下の研究を展開した。
１）自己・非自己識別機構の蛋白質構造化学的解明：アブラナ科植物の雌ずい因子である受容体キナーゼSRKの細胞外ドメインの異種発現系の構築を目指して様々なアミノ酸残基改変を行い、比較的可溶性の改変型発現蛋白質を得ることが出来た。一方、ナス科植物の花粉因子であるF-box蛋白質群SLFsに関しては、同様なアミノ酸残基改変を試みたが、発現蛋白質はいずれも凝集してしまい、現時点では有効な改変は見出されていない。
２）自他認識から受精阻害あるいは受精促進に至るまでの分子機構解明：アブラナ科植物の自家受粉時における受精阻害には、グルタミン酸受容体GLRsを介した乳頭細胞内へのCa2+流入が関与することが示唆されている。これを実験的に証明する目的で、GLRsの多重変異体の作出と解析を進めた。ナス科植物の他家受粉時における雌ずい因子S-RNaseの無毒化機構を解明する目的で、雌ずいを伸長中の花粉管内のS-RNaseの挙動について免疫組織化学的解析を進めた。
３）非自己から自己認識への転換機構の解明：ナス科およびバラ科におけるS-RNaseとSLFsとの相互作用解析系の確立に向けて、S-RNase蛋白質の異種発現系による発現条件の検討を進めた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2017-03-31

【配分額】40,560千円 (直接経費: 31,200千円、間接経費: 9,360千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】16K11197 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小胞体ストレス / 蝸牛 / 難聴 / 有毛細胞 / コルチ器 / ラセン神経節細胞 / シグナル伝達 / 蛋白質

【研究成果の概要】

蝸牛培養細胞において、小胞体ストレスの３つの主要pathwayであるPERK pathway, IRE1 pathway, およびATF 6 pathwayの評価を行った。その結果、IRE 1 pathwayはapoptosisなどの細胞死評価を行うのが可能であったが、その他の２つのpathwayは蝸牛培養細胞上では適切な染色が難しく、評価は困難であることが判明した。IRE 1 pathwayの特異的マーカーCHOPの評価は可能であったが、細胞死レスキューの有効な系の確立が困難であった。結果として、蝸牛有毛細胞死における小胞体ストレスの関与に関する新たな知見を得るのが困難であった。

【研究の社会的意義】

感音難聴は未だ有効な治療法に乏しく、病態生理の解明と有効な治療戦略の確立が急務である。これまでのモデル動物や臨床試験から、一部の難聴の発症機序に酸化ストレスが関与することが明らかとなっているが、抗酸化剤antioxidantによる治療効果は動物実験レベルですら十分でない。そのため酸化ストレス以外の病態生理も難聴の発症に関与している可能性が考えられる。そこで本研究では、蝸牛培養細胞の細胞死における、小胞体ストレスの関与を明らかにすることを目的としたが、有意義な結果を得ることが困難であった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】15H04338 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

結晶構造解析 / Gタンパク質共役型受容体 / シグナル伝達 / タンパク質 / G蛋白質共役型受容体 / 蛋白質 / 癌

【研究成果の概要】

ケモカイン受容体CXCR7は、様々ながん細胞で大量に発現しており、新たな抗がん剤の創薬ターゲットと考えられているGタンパク質共役型受容体（GPCR）である。CXCR7の特徴としては、他のケモカイン受容体と配列上の類似性が高いにもかかわらずGタンパク質を介す情報伝達経路を持たず、βアレスチンを介す情報伝達経路だけを持つことが挙げられる。本研究計画では、創薬や機能解明に役立てるため、CXCR7の構造解析を目指した。現状では、結晶が得られず、構造解析は成功していない。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】26440047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / ストレス / シグナル伝達 / 生理活性

【研究成果の概要】

ニューログロビン（Ngb）は酸化ストレスから神経細胞を保護する働きを持つ。以前、我々は、ヒトNgbが酸化ストレス下にヘテロ三量体G蛋白質αサブユニット（Gαi）と特異的に結合しGDP解離阻害因子として働くことを明らかにした。本研究では、ヒトNgbのGlu53, Glu60, Glu118が、Ngbの細胞保護能及びGαi1との結合に重要であることを明らかにした。さらに、ヒトGαi1のLys46, Lys70, Arg208, Lys209, Lys210がヒトNgbとの相互作用に重要であることを明らかにした。以上の結果をもとに、ヒトNgbとGαi1との複合体の構造モデルを提唱することに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】25460033 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

GPCR / NMR / 膜タンパク質 / 構造生物学 / 膜蛋白質 / 蛋白質 / 薬学 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

NMRシグナルの感度を従来法の 5 倍以上とする、昆虫細胞発現系で重水素化したタンパク質を調製する手法を開発した。加えて、重水素化を施した上で、rHDLの脂質二重膜中に再構成したb2ARを調製して、各種リガンド結合状態のNMRスペクトルを取得することにも成功した。その結果、rHDL中では、活性型の量比がミセル中より多く、交換速度がミセルにおける値の数分の一であることが示された。
さらに、アレスチンシグナルを選択的に活性化する状態のGPCRのNMRシグナルを観測した。その結果、GPCRが複数の活性型の構造平衡状態にあり、各活性型の割合がシグナル選択性を決定していることが明らかなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】発がん

【研究領域課題番号】24650610 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / 蛋白質 / 酵素 / 細胞増殖 / 胎盤 / 乳腺 / 腫瘍 / タンパク質

【研究成果の概要】

１）PTEN阻害タンパク質CSIGがNrk結合分子として同定され、NrkがAkt経路を抑制して胎盤スポンジオトロホブラストの増殖を抑制することが示唆された。また、Nrk欠損スポンジオトロホブラストで細胞周期停止因子p27の発現低下が見出され、Nrkがp27の発現誘導あるいは分解抑制を引き起こすことが示唆された。
２）乳腺腫瘤を発症したNrk欠損♀マウスにおいて血中および卵巣のエストロゲン・レベルが上昇していることを見出した。また、授乳期および高齢の野生型マウスの卵巣でNrkの発現が検出され、Nrkが卵巣でエストロゲン産生を負に制御することにより、乳腺上皮細胞の過増殖を防いでいることが示唆された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】数理物理・物性基礎

【研究領域課題番号】23740300 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

統計力学 / 非線形力学 / 幾何学 / DNA / クラスター / タンパク質 / 分子モーター / 小惑星 / 非平衡統計力学 / 応用数学 / 分子機械 / 天体力学 / 多体問題 / 国際情報交換（米国、ドイツ） / 国際情報交換（米国，ドイツ） / シグナル伝達 / 宇宙ミッション / 非線形科学 / 国際情報交換　アメリカ合衆国 / キラリティ / 国際情報交流 / アメリカ、ドイツ

【研究成果の概要】

本研究課題では、原子分子集合体や生体高分子などの高度な秩序構造と機能を有する階層的分子システムの集団運動のメカニズムを、統計力学、非線形力学、幾何学の手法に基づき明らかにする研究を進めた。特に、オブレート-プロレート遷移や解離反応など、質量分布を大きく変える原子分子集合体の集団運動の駆動機構や、DNAを始めとする生体高分子の非対称な弾性特性と高次構造の形成機構の一端を明らかにした。さらに、分子系と天体系の力学的類似性に注目し、小惑星の遷移ダイナミクスに関する研究を推進した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011-04-28 - 2015-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】23750182 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 細胞・組織 / 生体分子 / 1 分子計測(SMI) / 生体関連化学 / 機能性分子 / 光制御 / 1分子イメージング / シグナル伝達 / 蛋白質 / 1分子計測（SMD）

【研究成果の概要】

本研究では、細胞内シグナル伝達における受容体クラスター形成の意義の理解を目的とした。この目的のため、シグナル伝達分子Aktの1分子動態観察と、受容体ナノクラスターの人工的形成法の開発を行った。前者では、細胞外からのシグナル入力により、Aktの細胞膜滞在時間が延びることを見出した。この結果は、Akt動態が細胞表面の受容体クラスターに影響されることを示している。後者では、光感応性タンパク質を融合した受容体および精製タンパク質の構築に成功し、クラスター形成の光制御を実現する道具の準備を整えた。以上のように、本研究では受容体クラスターがシグナル伝達に重要な機能を果たしていることを示し、その重要性を構成的に証明する礎を築いた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】23229001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 遺伝子 / シグナル伝達 / Ｇタンパク質 / 小胞輸送 / 栄養センシング / 生体分子 / Ｇサイクル / Ｇ蛋白質 / G蛋白質 / Gサイクル / ゲノムプロジェクト

【研究成果の概要】

Ｇ蛋白質は、GDP/GTP結合型のコンホメーション転換（Ｇサイクル）により、細胞の様々なシグナル伝達系で分子スイッチとしての役割を果たしている。本基盤研究(S)では、これまでに解析の進んだ刺激依存活性化型とは異なる、特異な生化学的特性や構造を有する新奇のＧ蛋白質群を対象に、それらの存在様式・作動原理を細胞レベルから個体レベルに至るまで広範な階層で解析した。これらの新奇Ｇ蛋白質群のＧサイクルは、リソソームの形成・成熟やエンドサイトーシス・エキソサイトーシスといった細胞内小胞輸送経路で機能していることを新たに見出し，Ｇ蛋白質が果たす生理的役割の拡大に貢献した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】225,810千円 (直接経費: 173,700千円、間接経費: 52,110千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】22780249 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

代謝 / 内分泌制御 / シグナル伝達 / 発現制御 / 核酸 / タンパク質 / 応用動物

【研究成果の概要】

我々は、インスリンやインスリン様成長因子(IGF)の細胞内シグナルを仲介するインスリン受容体基質(IRS)がRNAと複合体を形成していることを見出し、この複合体形成の意義を解析した。その結果、IRSは、(1)small nucleolar RNA(snoRNA)の生合成を促進して、リボソームの成熟・活性化を進める、(2)mRNAの配列内リボソーム進入部位(IRES)を介した翻訳を調節する、という多面的な意義を有している可能性を示した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】22247031 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分裂 / 細胞質分裂 / 収縮環 / アクチン / ミオシン / 細胞 / タンパク質 / 微細構造 / 生体分子 / シグナル伝達 / 電子顕微鏡 / 細胞周期 / 細胞運動

【研究成果の概要】

細胞質分裂は収縮環の収縮によって細胞が中央部からくびり切れることによりおこる。私は分裂酵母の収縮環ー細胞膜複合体（細胞ゴースト）を単離し、ATPを加えて収縮環を人為的に収縮させることに初めて成功した。この実験系を用い、アクチンの脱重合は収縮そのものには必須ではないことなどいくつかの性質を明らかにできた。また収縮環形成の際のアクチンの分裂位置への集合にはミオシンVが関与していることが示唆された。ウニ卵の分裂溝にアクチン重合を促進するuDiaがアクチンと共存することも示した。さらにカエル卵抽出液を人工脂質膜に封入することにより、脂質膜小胞中でアクチンの流れが起こることを見いだした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010-04-01 - 2015-03-31

【配分額】39,910千円 (直接経費: 30,700千円、間接経費: 9,210千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】21510229 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞・組織 / 生理活性 / 蛋白質 / シグナル伝達 / 生体分子

【研究成果の概要】

低分量基底膜蛋白質であるAZ-1は、血管基底膜の構成因子として構造的細胞外マトリックス蛋白質、血管内皮増殖因子、同受容体、インテグリン群との結合能を持つ多価相互作用因子であることが判明した。この相互作用が血管内皮細胞の接着、増殖、管腔形成などを制御することにより、血管内皮増殖因子による細胞の活性化が抑制されて血管内皮の恒常性が維持されうることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】21791413 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / シグナル伝達 / 遺伝子 / 蛋白質 / 骨軟部腫瘍 / 転移 / CD4 / ADAM17 / 肉腫 / 発現解析 / CD44 / APAM17

【研究成果の概要】

上皮系悪性腫瘍は浸潤能・転移能を獲得する際、上皮性細胞としての性格を失い、間葉系細胞様に変化するEpithelial Mesenchymal Transition(EMT)という過程を経る。EMTの中でも中心的な役割を担うCD44とTNFαconverting enzyme(TACE/ADAM17)がそもそも間葉系由来の悪性腫瘍である、原発性悪性骨・軟部腫瘍の浸潤能・転移能獲得においてどのように機能しているかに関して、その臨床検体を用いて解析を行った。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】20247011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 遺伝子 / シグナル伝達 / G蛋白質 / 小胞輸送 / リソソーム / Gサイクル / ゲノムプロジェクト / Processing body

【研究成果の概要】

G蛋白質は、GDP/GTP結合型のコンホメーション転換(Gサイクル)により、細胞の様々なシグナル伝達系で分子スイッチとしての役割を果たしている。本基盤研究(A)では、細胞内小胞の選別輸送経路をモデル系として、Gサイクルが時空間的あるいは作動様式に基づいて制御される機構を解析し、特異な生化学的特性や構造を有する新奇のG蛋白質が、リソソームの形成・成熟やエンドサイトーシス・エキソサイトーシスなどといった細胞内エンドソームの動態制御に介在していることを見出した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】42,900千円 (直接経費: 33,000千円、間接経費: 9,900千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】19570121 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 酵素 / ストレス / 脳・神経 / シグナル伝達 / 蛋白質工学 / グロビン蛋白質 / 細胞死保護 / 酸化ストレス

【研究成果の概要】

ニューログロビン(Ngb)は酸化ストレスに応答しシグナル伝達過程を制御することにより、神経細胞死を防いでいる可能性が高い。本研究では、この仮説を検証することを目的とした。その結果、神経細胞死抑制活性にヒトNgb の「GDP 解離抑制蛋白質」としての活性が極めて重要であることを実証した。また、魚のNgb が「細胞膜貫通特性」を持つことを発見し、さらに、蛋白質工学的手法を駆使することにより、培地に加えるだけで細胞内に導入され細胞を保護する新規人工蛋白質の創製にも成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】18207008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 蛋白質 / 遺伝子 / ゲノムプロジェクト / G蛋白質 / Gサイクル

【研究成果の概要】

本研究では、これまでの申請者らによる三量体G蛋白質に関わる研究経験と実績を踏まえて、主に低分子量G蛋白質のGサイクルが重要な役割を果たす物質輸送系(エンドサイトーシスによる小胞輸送とトランスポーターのベクトル輸送系)及び発生過程での栄養物質の取込みに依存したシグナリング経路の変動をモデルとして統合的なシグナリング・マップの構築を目指し、以下の知見を得た。1.新奇Gタンパク質Ar18は、線虫個体内のマクロファージ様細胞(Coelomocyte)の観察からリソソームに局在した。その欠失変異体では後期エンドソームとリソソームが小型化する形態異常を認め、Ar18が後期エンドソームからリソソームの形成に必須の役割を果たすことを明らかにした。2.Ar113は、N末端側のArfドメインに加えて、SH3領域が結合するPro-rich配列を有したが、線虫Ar113欠失変異体は、線虫の運動能に障害をもつ表現型を示し、Arl13Bが細胞運動において役割を果たすことが推定された。3.Rab45は、C末端側のRab-GTPaseドメインに加えて、N末端側からEF handとcoiled-coil領域をもつ分子量約80Kのユニークな構造の新奇G蛋白質である。Rab45はそのcoiled-coil領域を介して多量化する特性をもち、培養細胞に過剰発現すると、中心体付近で巨大な小胞に局在化してエキソサイトーシスに介在するRabのメンバーをその小胞に集積させる作用を有した。4.線虫Di-Rasの欠失変異体は、運動神経機能(神経終末からのアセチルコリン放出)が低下する表現型を示し、Di-Rasが神経細胞の機能維持に関与することが推定された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】49,790千円 (直接経費: 38,300千円、間接経費: 11,490千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】18890051 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 遺伝学 / 生理学 / 細胞・組織 / 蛋白質

【研究成果の概要】

インスリン/IGFシグナリング(IIS)経路とAMP活性化キナーゼ(AMPK)経路は、糖尿病や腫瘍形成に深く関与し、mTOR経路においてクロストークすることが示唆されてきた。これらの情報伝達経路は動物間で高度に保存されているが、mTORの活性制御やその下流因子は不明な点が多い。これまでに、我々は線虫のIIS経路とAMPK経路は飢餓時の生存維持や細胞増殖の抑制に重要である知見を得てきた。そこで今回の研究では線虫の順遺伝学を駆使して、IIS経路とAMPK経路の下流で働く新規遺伝子の探索を試みた。まず、IIS経路が恒常的に活性化しているPTEN(daf-18遺伝子)とAMPKのαアイソフォームをコードする二つの遺伝子(aak-1,2)がmTORやそれと相互作用するraptorやrhebと遺伝学的相互作用することを認め、哺乳動物と同様に線虫でもIIS経路とAMPK経路の下流でmTOR経路が機能することが示唆された。しかしながら、mTORの重要な下流因子であると考えられているS6キナーゼのnull変異はPTENやAMPK変異体の表現型を抑制しなかった。S6キナーゼ以外にmTORの下流因子として4E-BPが他の動物では存在するが、線虫には保存されておらず、mTORは未知の基質を介して細胞増殖を制御している可能性が示唆された。そこで、mTORの近傍や下流で機能する未知の因子を同定するべく、飢餓時の生存率を指標として幾種類かの順遺伝学スクリーニングを行った。その中で、AMPK変異体の飢餓時の生存率を抑制する変異体としてtd81が単離された。現在td81のポジショナルクローニングを進めており、その原因遺伝子は既知のmTOR経路の遺伝子でない知見が得られている。今後原因遺伝子を同定し、哺乳培養細胞実験系で機能解析を進めていく予定である。

【研究種目】若手研究(スタートアップ)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】2,620千円 (直接経費: 2,620千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】17370066 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 蛋白質 / 組織・細胞 / アダプター / リン酸化 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

チロシンキナーゼは細胞外環境からの情報が細胞内シグナルへと変換される際に必須のシグナル分子であり、その多くはドッキング蛋白質と呼ばれるアダプター分子をリン酸化することによって細胞内シグナルを適切に制御している。申請者らは新規ドッキング蛋白質としてDok-1を発見し、その類縁分子であるDok-2と共にサイトカイン受容体やLPS受容体の下流において、骨髄球細胞の造血や自然免疫応答の恒常性の維持に必須のシグナル分子として機能していることを解明してきた。そこで、本基盤研究においては、T細胞におけるDok-1/2の機能について検討し、両者がT細胞受容体シグナルの抑制因子であり、獲得免疫の負の調節因子として機能していることを明らかにした。また、この抑制機能にはC末端領域にあるSH2結合配列が不要であることから、既知のアダプター分子としての機能とは異なる作用機構が予見された。さらに、Dok-1/2と同じく血球に高発現するDok-3については、Dok-1/2とは異なり、そのチロシンリン酸化によってGrb2と会合することにより、間接的にRasの活性化を阻害し得ることを解明した。既に、Dok-1/2/3三重欠損マウスの樹立にも成功し、造血系細胞に高発現するDok類縁分子全体の機能解析を進めている。
他方、我々は新規のDok類縁分子としてDok-7を同定し、それが、筋特異的な受容体型チロシンキナーゼであるMuSKの活性化因子として機能し、MuSKと同じく、神経筋接合部の形成に必須であることを発見した。さらに、神経筋接合部の形成不全を伴う肢帯型の先天性筋無力症がdok-7遺伝子の両アレル生の変異によって発症することを世界に先駆けて解明した。これらの発見は、細胞内因子による受容体型チロシンキナーゼの活性化と言う未知の分子機構の存在を意味するだけではなく、今までその原因が不明であった筋無力症の診断法を提示し、また、その治療法開発の基盤となる重要な知見である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)