【研究分野】生理学一般

【研究領域課題番号】23790265 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達・分化 / 破骨細胞 / リン酸化 / イノシトール三リン酸受容体 / NFATc1 / Cot kinase / シグナル伝達 / 分化 / イノシトール３リン酸受容体

【研究成果の概要】

本研究期間内では、骨芽細胞と破骨細胞が直接接触することによりカルシウムオシレーション非依存的な破骨細胞分化シグナルが活性化すること、この分化シグナルを誘導する分子は骨芽細胞の膜画分に存在することが明らかとなった。また、骨芽細胞との接触により破骨細胞内のCotkinase(リン酸化酵素)が活性化され、破骨細胞分化のマスター分子であるNFATc1をカルシウム非依存的に活性化する分子機構を明らかにした。これらの結果は、新たなNFATc1活性化機構を通した破骨細胞分化制御機構を発見した、という点で非常に興味深い知見といえる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】生理学一般

【研究領域課題番号】21790220 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分化 / 破骨細胞 / カルシウムオシリーション / 細胞融合 / シグナル伝達 / イノシトール三リン酸(IP3) / カルシウムオシレーション / 骨 / イノシトール3リン酸 (IP3) / IRBIT

【研究成果の概要】

IRBITノックアウトマウス由来の細胞を用いた解析により、IRBITをノックアウトすると多核の破骨細胞形成が亢進することが分かった。IRBITノックアウト細胞では、破骨細胞分化誘導時に観察されるカルシウムオシレーションを呈する細胞の割合が増えていること、細胞融合のステップが亢進していることから、IP_3Eを介したカルシウムシグナルが細胞融合を亢進する働きを担っていること、そのカルシウムシグナルはIRBITによって負に制御されていることが明らかとなった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】眼科学

【研究領域課題番号】19592038 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

網膜 / 視機能 / 発生 / 再生 / 炎症 / サイトカイン / 分化 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

自然経過では再生しない網膜視細胞を分化誘導し、網膜機能を再生することは、現代の大きな課題の一つである。しかし、これまでの研究では、網膜細胞の中でも視細胞は誘導されにくいことが知られていた。一方、再生すべき網膜微小環境では通常とは異なった各種シグナルが活性化されている。その中で今回我々は、視細胞分化と、炎症刺激でも活性化されるNotchシグナルの関係を分子レベルで解析し、Numbが視細胞分化を許容し得ることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】12470348 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / シグナル伝達 / チロシンリン酸化 / Srcキナーゼ / ヒストンアセチル化 / レドックス / シグナル伝達経路 / 分化 / 性ステロイドホルモン / 脱落膜 / チロシンキナーゼ / c-Src

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜の多様な機能発現を担う細胞内シグナル伝達経路の解明を目的として、チロシンリン酸化、ヒストンアセチル化、酸化還元(レドックス)反応について検討し、以下の点を明らかにした。
1.リン酸化:内膜分化(脱落膜化)系において、種々の蛋白のリン酸化状態が変化すると同時に、src familyチロシンキナーゼのひとつであるc-Srcが活性化していた。活性化型c-Srcを認識する抗体clone 28を用いることにより、ヒト子宮内膜及び脱落膜において、分化に伴って活性化型の発現増強を検出した。次にsrc familyチロシンキナーゼの阻害剤を用いたところ、逆説的にc-Srcは活性化し、分化も促進された。阻害剤の特異性の限界を鑑み、c-Srcの野生体および一部の変異体を発現するadenovirusを作製し、内膜細胞に感染させてその発現を確認した段階である。一方、2次元電気泳動法によりチロシンリン酸化蛋白を網羅的に解析し、分化特異的なリン酸化スポットを約20種類同定した。また、齧歯類の脱落膜化においても、活性化型の発現が増強しており、現在c-Srcノックアウトマウスの内膜分化能を検討中である。
2.ヒストンアセチル化:脱アセチル化酵素阻害剤の内膜分化への影響を検討したところ、細胞・薬剤特異的に性ステロイド依存性分化を促進した。その際、一部のコアヒストンの特定の部位がアセチル化されていた。
3.レドックス反応:内膜の増殖・分化の際、レドックス環境を調節するチオレドキシンが誘導された。分化過程では細胞外へ放出され、paracrine/autocrineに増殖を調節する可能性が示された。
内膜機能発現には、様々な蛋白修飾を通じたシグナル伝達経路の活性化が重要であることが示唆された。雌性生殖器官疾患に対して、シグナル伝達を標的にした創薬および治療開発の可能性を示唆する研究成果が得られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】16,600千円 (直接経費: 16,600千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】10670757 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

MAPキナーゼ / ERK / p38 MAPキナーゼ / JNK / 発生 / 腎 / シグナル伝達 / 腎発生異常 / P38MAPキナーゼ / 後腎間葉細胞 / p38MAPキナーゼ / P38 / MKP-1 / 分化 / p38

【研究成果の概要】

細胞内シグナル伝達の中核的酵素MAPキナーゼ(MAPK)スーパーファミリーの腎発生における意義を検討した。まずMAPKとMAPK不活化酵素MAPK phosphatase 1(MKP-1)の腎における発現を検討した。Extracellular signal-regulated kinase (ERK)とp38MAPK(p38)、MKP-1は幼若腎に強く発現し、c-Jun N-terminal kinase (JNK)は成熟腎に発現した。活性型のERK、p38、JNKの発現もそれぞれの蛋白発現と相関した。免疫組織学的検討では、ERKはネフロン形成に伴って皮質から髄質側へ移行した。これに反し、p38は腎全体にびまん性に発現した。MKP-1の空間的発現はp38のそれと同様であった。JNKは成熟腎の尿細管すべてに発現した。
次に腎発生における機能的意義を検討した。ラット腎をERK活性化酵素MEK阻害剤PD98059、UO126、またはp38阻害剤SB203580存在下で培養、腎成長ネフロン形成、尿管芽分岐への影響を検討した。,ERKはネフロン形成と尿管芽成長に、p38は腎成長とネフロン形成に関与することが示された。
ERK、p38が腎発生において必要であることから、ERK、p38の異常により腎発生異常が生じる可能性が考えられる。そこで最も頻度の多い腎奇形、異形成腎におけるMAPキナーゼの発現を検討した。胎生10週-21歳のヒト多嚢胞性異形成腎6例につき検討、嚢胞壁におけるp38、ERKの発現増加、活性化と、JNK発現低下を認めた。同様の変化は多発性嚢胞腎モデルpcyマウス嚢胞壁にも観察された。
p38が腎成長、ネフロン形成に、ERKがネフロン形成に関与することから、腎成長、ネフロン形成に関与書,するbFGFのシグナル伝達におけるMAPキナーゼの役割を検討した。培養後腎間葉細胞においてbFGF刺激によりp38、ERKは活性化され、細胞増殖・遊走を媒介することが示された。
多嚢胞性異形成腎には尿路閉塞が高頻度に合併し、発症への関与が示唆される。そこでヒツジ胎仔尿路閉塞モデル腎におけるMAPキナーゼの発現を検討した。胎生期尿路閉塞腎の嚢胞、異形成尿細管において、細胞増殖亢進に伴いp38、ERK、P-ERKの発現増加、JNKの発現減弱が認められ、嚢胞形成に関与することが示された。
以上、正常、異常腎発生におけるMAPキナーゼの意義が明らかにされた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 2001

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07559018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 造血因子 / RAS / STAT / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 造血 / JAK / レトロウイルス / アポトーシス / サイトカイン受容体 / JAKキナーゼ / 転写因子 / 分化

【研究成果の概要】

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。
サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。
IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。
優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】05680618 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エリスロポエチン / 誘導遺伝子 / 受容体活性化 / プロモーター / 細胞増殖 / 分化 / シグナル伝達 / 受容体 / 情報伝達機構 / 活性化 / キメラ分子 / 分子生物学 / 細胞分化

【研究成果の概要】

我々はエリスロポエチン(EPO)受容体の活性化機構を解明する目的でチロシンキナーゼ型受容体(EGF受容体)の細胞外ドメインとEPO受容体細胞内ドメインのキメラ分子を作成しその機能を解析した。その結果キメラ分子はリガンド(EGF)に依存して2量体化し、細胞増殖および細胞分化(グロビンの合成)を誘導することがわかった。したがってエリスロポエチン受容体はリガンドに依存した2量体化によって活性化され、その細胞内ドメインに増殖分化のシグナルを発生するのに必要十分な機能がそなわっていることが明らかとなった。またEPO受容体の細胞内ドメインのC末端半分の約100アミノ酸残基を削ると、むしろ強く増殖や分化を誘導するようになった。したがって分化のシグナルに必須の領域はEPO受容体細胞内ドメインの膜に近い約120アミノ酸の範囲にあり、増殖のシグナルに必須の領域とオーバーラップしておりC末端半分はそれらのシグナルを負に調節していることになる。エリスロポエチン受容体からのシグナルによって誘導される遺伝子は細胞増殖や赤芽球分化を調節する重要な働きがあると考えられる。そこで我々はサブトラクション法を用いて、まずエリスロポエチン受容体によって誘導される遺伝子を複数クローニングした。今回SH2ドメインを有する新規遺伝子CIS(cytokine-inducible-SH2 protein)を発見しその機能解析を行った。誘導の分子機構を解析するためにプロモーター領域約1キロベースをクローニングした。今後転写活性化に必要なシスエレメントを同定し、そこに作用する転写因子を明らかにする。さらにCISは活性化されたEPO受容体やIL3受容体に会合することを明らかにした。今後CISを経由するシグナル伝達経路を明らかにし、またトランスジェニックマウスなどで生理機能を明らかにしたい。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】04454105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳腺 / レセプター / プロラクチン / インシュリン / MAPキナーゼ / 細胞増殖 / 成長因子 / 分化 / 乳腺上皮 / ホルモン / P34^<cdc2>キナーゼ / P32^<cdk2>キナーゼ / 分裂調節 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)