【研究領域課題番号】18H02002 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸化学 / 分離化学 / 核酸アプタマー / キャピラリー電気泳動 / DNA / RNA / 蛍光 / バイオセンサー / 核酸 / 低分子化合物 / アプタマー / 分子進化工学 / 核酸科学 / 分子認識化学

【研究成果の概要】

本研究課題では、申請者が見出したマイクロ粒子支援型キャピラリー電気泳動 MACE を、様々な標的分子を対象とする核酸アプタマー選抜実験（SELEX）系に導入し、従来有機合成化学的アプローチで改善が試みられていた SELEX 系に未だ大きな伸び代が存在すること、さらに“分析化学”的アプローチで SELEX 法の大幅な質の向上が可能であることを実証することを目的とした。その結果、MACE-SELEX 法が、可溶性蛋白質、膜タンパク質、低分子などの幅広い標的に対して機能し、高い結合親和性をもつ DNA アプタマーの獲得が可能であることを明らかとした。

【研究の社会的意義】

核酸やペプチドを骨格とした分子認識能を有する生体高分子は、創薬分野での利用が期待されている中分子に分類される薬剤モダリティである。薬剤として高い潜在能力を有する候補中分子の獲得は、分子ライブラリーの中から、進化分子工学的手法により選抜する。従来有機合成化学的アプローチで改善が試みられていた SELEX 系に未だ大きな伸び代が存在すること、さらに“分析化学”的アプローチで SELEX 法の大幅な質の向上が可能であることを実証することを目的とした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究領域課題番号】18K08406 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA / 核酸 / DNA / DAMPs / 自己免疫 / 炎症 / 内在性RNA / 自然免疫 / TLR / サイトカイン

【研究成果の概要】

免疫応答の活性化作用を有する内在性のRNAについて解析を行い、RNAを中心とした内在性の核酸の放出、放出された核酸への応答、それらを引き起こす物質について多くの知見が得られ、さらに、それらの重要性を示唆する知見が疾患モデルマウスやヒトサンプルから得られた。また、
一連の研究を通して、細胞外に放出された核酸を解析する解析系の構築が推進された。

【研究の社会的意義】

炎症・免疫応答を活性化する内在性RNAは、今までに多様な疾患との関わりが示唆されており(SLE、 RA、 強皮症、乾癬、すい臓がん、糖尿病など)、疾患の増悪・発症の原因になり得る重要な因子だと考えられるが、その実態には不明な点が多く残されている。本研究によって内在性核酸の放出、核酸への応答、それらを引き起こす物質について得られた多くの知見やそれらの解析系は、関連する様々な疾患の病態解明や創薬に寄与するものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】分子生物学およびその関連分野

【研究領域課題番号】17K19344 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ubiquitin / K63 / DNA / RNA / 核酸 / ポリユビキチン / E2 / pH / ユビキチン / 翻訳後修飾

【研究成果の概要】

K63Ub鎖は、環境変化・刺激応答などによる標的タンパク質の機能変換の惹起だけでなく、鎖自体もシグナルとして機能することから、細胞内では迅速かつ正確な鎖形成の制御がなされていると考えられる。しかしK63Ub鎖の形成にはE2酵素Ubc13/Mms2複合体が必須であるが、伸長の分子メカニズムは未解明の部分が多い。我々はin vitroにおいて核酸（RNAやssDNA）がE3非依存的にK63Ub鎖形成を促進することを発見していた。本研究ではこの反応の分子メカニズムに着目した。解析の結果、E2がpH変化によって核酸に結合し、核酸ーE2複合体がUb鎖伸長の足場となり反応が進行する可能性を明らかにした。

【研究の社会的意義】

Ub鎖の形成促進は、これまでE3酵素によってのみ触媒されると考えられてきた。しかしE3がどのようなメカニズムでUb鎖の伸長を促進しているかの詳細は未解明の部分が多い。我々はK63Ub鎖伸長の活性本体であるE2に着目し、E2の活性を上昇するメカニズムを探索した。その結果、核酸が直接E2と結合し、構造体としてK63Ub鎖の形成を促進することを生化学解析や高速AFMを用いた１分子解析から明らかにした。反応メカニズムの解明はUb分野への貢献が大きく、pHによるタンパク質の活性制御は酵素学的にも意義が高い。DNA、RNAに関わる細胞内機構を中心に、pH変化による制御機構という新しい分野を見出した。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2017-06-30 - 2019-03-31

【配分額】6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】17H04886 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸医薬 / 化学修飾核酸 / アンチセンス核酸 / RNaseH / オフターゲット効果 / 核酸化学 / RNase H / DNA / RNA / アンチセンス / 有機合成 / 分子動力学計算 / 修飾核酸

【研究成果の概要】

核酸-タンパク質複合体形成に最適化した化学修飾の開発により、RNaseH依存型アンチセンス核酸のオフターゲット効果を抑制する方法論の構築を行った。X線結晶構造解析で見られた構造を初期構造に分子動力学計算によって複合体形成における構造的特徴を抽出し、複合体形成に適した構造に固定化する化学修飾を設計、合成した。再構成系でRNaseHの複合体形成位置を確認したところ、予期した通り、複合体形成の制御に成功した。またトランスクリプトーム解析より、オフターゲット遺伝子の数の抑制を確認、細胞生存率の向上がみられた。本成果により、安全性の高い核酸医薬品の開発に新たな方法論を提唱することができた。

【研究の社会的意義】

核酸医薬品は、従来は治療することのできなかった疾患に対し、治療法を開発することができる新たな医薬品の形態です。非常に効果的な方法論である一方、予期せぬ標的外遺伝子の作用は安全性上の懸念となり、核酸医薬品の迅速な開発を妨げてきました。本研究では核酸医薬品の安全性上の懸念の解決を目指し、核酸医薬品の一種であるRNaseH依存型アンチセンス核酸において、原理的に安全性が向上する方法論を提唱しました。本成果は、核酸医薬品の今後の迅速な開発に貢献することが期待されます。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】19,240千円 (直接経費: 14,800千円、間接経費: 4,440千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】16K05836 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トリアゾール / RNA / クリック化学 / mRNA / duplex / π積層 / 芳香族分子 / 二重鎖 / CuAAC / DNA / tRNA / 翻訳反応 / ヌクレオシド / アミノアシルtRNA / 非天然型アミノ酸 / ペプチド

【研究成果の概要】

核酸伸長反応に高効率なクリック化学を活用したトリアゾール連結核酸の高効率合成法を開発し，その生命科学における機能展開を実現した．当初予定していたRNAとアミノ酸とのクリック連結法を探索するなかで，DNA末端へのアジド化とそのクリック連結法を開発し，これが次世代DNAの鋳型DNA調整に活用可能であることに注目して簡便鋳型合成法を実現した．さらに，当初の合成標的であった修飾tRNAから，全く開拓例がなく，より挑戦的な修飾mRNAの開発に標的を切り替え，初の非リン酸型コドンをもつ修飾mRNAを実現した．こうした修飾RNAの二重鎖形成におけるトリアゾール連結部の効果を熱力学的解析から明らかにした．

【研究の社会的意義】

非リン酸型核酸は高い化学的・熱力学的安定性に加え，多様な機能性が期待される次世代型バイオ材料であるが，その合成上の制約により機能展開に至った例はごく限られていた．本研究では，高効率なクリック化学に着目して，糖保存・非リン酸型RNAでの最長の例を実現し，その二重鎖形成における熱力学的特性を初めて明らかにした．さらにこうした非リン酸型の機能展開として，これまで例のない翻訳反応におけるmRNAとしての機能性評価や，次世代シークエンサーのための鋳型DNA調整法を実現した．本研究により，これまでほとんど明らかとなってきていない非リン酸型RNA・DNAの機能性開拓を達成した．

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】25810094 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光核酸 / 三重鎖DNA / RNA / 緑色蛍光タンパク質 / GFP / 三重鎖 / DNA / 有機合成 / 蛍光プローブ

【研究成果の概要】

本研究では、生体内で機能する複数のRNAの同時検出を可能にする、マルチカラー蛍光核酸プローブの開発を目指した。本研究では、蛍光核酸プローブを効率的にマルチカラー化するために、すでに複数色の誘導体が知られている緑色蛍光タンパク質(GFP)の核をなす蛍光色素を用いた。さらに、この色素を標的核酸との結合に伴って光らせるため、起案者らが過去に開発したDNA三重鎖形成に基づく蛍光検出系を応用した。
その結果、種々のGFP色素を導入した蛍光核酸プローブの合成に成功し、モデルとなる標的核酸存在下において三重鎖形成させ、蛍光をoffからonへ変化させ検出することに成功した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】24350084 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子診断 / RNA / エピジェネティクス / １分子計測(SMD) / DNA / 1分子計測(SMD)

【研究成果の概要】

ターゲットRNAとプローブDNAのハイブリダイゼーションに加え、形成されるDNA/RNAハイブリッド構造の物性、すなわち、電荷移動特性を利用した1分子レベルRNA分析・診断法を開発した。電荷移動、電荷分離過程が蛍光の点滅（blinking）として観測されうることに着目し、暗状態の時間の長さ（OFF time）が、DNAの電荷移動特性を反映した電荷分離寿命（τ）と一致することを利用し、1分子レベルでDNA/RNAハイブリッドの電荷移動特性を調べ、RNA分析・診断へと応用した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】23655155 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA / 一分子観測 / 生物有機化学 / 蛍光相関分光 / blinking / 三重項励起状態 / 遺伝子診断 / 一分子計測（SMD） / RNA / 蛍光 / FCS / モレキュラービーコン / 診断 / １分子 / 一塩基多型

【研究成果の概要】

様々な蛍光分子を種々の位置に修飾したDNAを化学合成し、蛍光相関分光（FCS）測定により、蛍光分子の発光挙動を1分子レベルで見たときに観測される発光の点滅（＝blinking）において蛍光分子が光っていない時間（＝OFF time）からモレキュラービーコンの1分子レベル観測を試みた。OFF timeは、蛍光分子が溶媒から遮蔽されて、蛍光分子の三重項励起状態と酸素の反応速度が遅くなるほど長くなることがわかった。これにより、蛍光分子をモレキュラービーコンのループ部位に導入することにより、検出したいターゲット鎖をblinkingの観測により1分子レベルで検出することに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】20550148 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA / GFP / PCR / キャピラリー電気泳動 / タンパク質 / プロテオミクス / 翻訳 / 遺伝情報発見 / 蛍光蛋白質 / プライマー / 分子システム / 増幅反応 / 論理ゲート / 論理判断 / RNA / アミノ酸 / 蛋白質 / 転写 / 遺伝子 / 遺伝子工学 / マイクロ流体チップ / 蛍光イメージング / キャピラリ-電気泳動

【研究成果の概要】

酵素的なDNA 増幅反応と,増幅されたDNAをオンチップ電気泳動で分離する手段を組み合わせることにより,遺伝情報の発現に必要な配列をコードしたDNAの組換え,組み替えられた目的DNAの選別,DNAからmRNAへの転写,mRNAからタンパク質への翻訳,翻訳されたタンパク質の検出までの一連の流れを,細胞の助けを借りることなく達成する手法を開発した.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】16350087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

グリコウイルス / セラソーム / リボレギュレーター / 遺伝子運搬 / 遺伝子検出 / モレキュラービーコン / リードスルー / センスコドン / リポレギュレータ / siRNA / シグナル増幅 / DNA / RNA / リポソーム / 遺伝子診断 / 量子ドット / 肝細胞 / 制癌剤 / イバンドロネート

【研究成果の概要】

1.グリコウイルスを用いる遺伝子運搬
50nm程度のウイルスサイズが細胞導入に最適であることを見出し、3つのガラクトース残基をもつグリコウイルスがこの目的に最適であることを明らかにした。
2.セラソームを用いる遺伝子運搬
表面をセラミック被覆したリポソーム(セラソーム)は核酸との結合に際し融合せず、ウイルスサイズを維持した優れた遺伝子キャリアであることを明らかにした。
3.リボレギュレーターを用いる遺伝子のセンシング
リボレギュレーター型のモレキュラービーコン(プローブ)は特定の遺伝子(ターゲット)の存在下で特定のレポータータンパク質を発現し、シグナル増幅型の遺伝子検出に用いえることを明らかにした。
4.タンパク質へmRNAのタグ付け
read-throughribosome-display法を考案し、これにより、全長のタンパク質を自身をコードしたmRNAに繋ぎとめられることを明らかにした。
5.センスコドンへの非天然アミノ酸の導入
アミノアシルtRNA合成酵素の阻害際を用いるとセンスコドンに非天然アミノ酸を容易に導入できることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】15,200千円 (直接経費: 15,200千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】05453214 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アフィニティーラテックス / バイオセパレーター / セルアクチベータ- / 転写因子 / 点変異DNA / 膜糖蛋白 / ミクロスフェア / アフィニティ / ラテックス / スペーサー / DNA / RNA / RGDS / 転写制御 / ホルモン

【研究成果の概要】

スチレン-グリシジルメタクリレート共重合体粒子に生体成分またはその断片を固定し、新しいタイプのバイオセパレーター、バイオアクチベータ-を開発する研究を発展させた。
粒子として、上記のもの以外に、磁性体を包含しポリグリシジルメタクリレートで表面を覆ったものも作製し、同用途に供した。
バイオセパレーターとして新たに次の項目を検討した、(1)TBP(TATA Binding Protein)固定粒子で転写因子TFIIAを分離、(2)転写因子E4TF1のサブユニット固定粒子でsnRNP(small nuclear Ribonucleo-Protein)を精製、(3)sense DNA固定粒子でantisense RNAを分離、(4)DNA固定粒子で点変異DNAとそうでないDNAを分離。
(1)(2)については、生体成分のサブユニットもしくはさらに限定した機能部位のみを固定することでもアフィニティ分離が可能であることを示した。サイズの小さな成分の固定系では親水性スペーサーが機能向上に有用であった。(3)(4)では、単鎖DNA固定粒子の機能の拡張を図り、明るい展望をもつに至った。
バイオアクチベータ-としては、引き続きRGDS固定粒子による顆粒球の活性化を検討したが、今期は、粒子による刺激にともなう細胞内の変化、具体的には、活性酸素の産生、細胞内pHの変化を調べ、担体粒子の物理的ファクター(親疎水性や電荷など)が、RGDSによる特異的作用の発現を決定的に左右することを確認した。また、RGDS固定粒子を、溶解した膜糖蛋白GPIIbIIIaのセパレーターとして用い、高濃度、高純度で目的物を得て、得られたGPIIbIIIaの諸特性の検討も行なった。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】6,200千円 (直接経費: 6,200千円)

【研究分野】体育学

【研究領域課題番号】60480490 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

非運動性筋萎縮 / 筋萎縮 / 筋ジストロフィー / DNA / RNA / 筋の細胞分画 / C57BL / 6NJマウス

【研究成果の概要】

非運動性の筋萎縮のメカニズムを分子及び細胞レベルで明確にするため、筋ジストロフィー症モデルマウス(C57BL/6NJ)のホモ型(dy/dy)とヘテロ型(dy/?)を用いて、生化学的及び組織学的な測定と解析を行なった。そして、得られたデータを相互に比較・検討し、以下の知見を得た。
【1】細胞分画法により、萎縮が筋細胞のどの画分で特異的に発現するかをしらべた。1.2MKclで溶出される【I】画分(主に収縮タンパク質)のタンパク質量は、萎縮筋の方が非萎縮筋に比べて著明し低下していた。一方、低張塩溶液(25mMリン酸緩衝液,pH7.4)で溶出される【II】画分(主に膜酵素や膜タンパク質)や塩類溶液で溶出されない【III】画分(コラーゲン等の組合組織)のタンパク質量も、萎縮筋が非萎縮筋に比べて有意に低下した。
【2】萎縮筋における各画分のタンパク質成分の組成比は、非萎縮筋のそれらの比に比較して著しく異なることが各種の電気泳動の分析から判明した。
【3】筋細胞内の核酸(デオキシリボ核酸〈DNA〉,リボ核酸〈RNA〉)量は、筋の萎縮の程度がより進行すると著明に増加した。また、組織学的検索により、細胞1個あたりの核の数が有意に増加することを認めた。さらに、DNA1個あたりのタンパク質含有量は、筋の萎縮によって著しく低下した。このことは、筋の萎縮によって1個あたりの筋細胞のサイズが小さくなること、即ち筋の細胞容積が小さくなることを示している。同様な現象を組織学的なデータ(筋細胞の断面積及び縦断面の解析)からも得た。
【4】本研究により、筋の萎縮の指標として以下のパラメータが得られた。1)DNA量に対するRNA量の比, 2)DNA量に対するタンパク質量の比, 3)RNA量に対するタンパク質量の比,および 4)筋タンパク質量の各分画(【I】〜【III】)の比。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1985 - 1986

【配分額】300千円 (直接経費: 300千円)