Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

個別化医療 / 抗癌剤 / 薬剤感受性 / 個人差 / バイオマーカー / プロテオーム / SELDI-TOF MS / オキサリプラチン / プロテインチップ / SELDI-TOFMS

本研究では、抗癌剤反応性の個人差解明を目指し、薬効発現本体であるタンパク質を標的としたプロテオーム解析により抗癌剤感受性バイオマーカーを見出すことを目的とした。初年度(平成19年度)は、Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF MS)を用いて、オキサリプラチン(L-OHP)感受性の異なる複数のヒト大腸癌細胞の細胞内タンパク質の発現プロファイル比較解析を行い、ピーク強度がL-OHP感受性(IC_<50>値)と強い相関を示すピーク(11.1kDaタンパク質)を見出した。
平成20年度はこのタンパク質の同定を行なった。まずSELDI-TOF MSを用いてこの11.1kDaタンパク質の等電点(pI)および相対分子質量を推定し、11.1kDaタンパク質の高発現細胞HT-29および低発現細胞COLO320の細胞内タンパク質を二次元電気泳動法により分離した。COLO320と比較してHT-29で高発現を示すスポットの中から、推定したpIおよび相対分子質量に基づきスポットを選択し、そのゲル内消化サンプルをliquid chromatography/mass spectrometry (LCMS-IT-TOF)により分析し、得られたMS/MSスペクトルについてMS/MSion searchを行った。その結果、この11.1kDaタンパク質をprotein S100-A10であると同定した。S100A10の発現は、S100A10モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。
以上より、ヒト大腸癌細胞において、L-OHP感受性と強い相関を示すタンパク質はprotein S100-A10であることを見出した。

個別化医療 / プロテオーム / メタボローム / バイオマーカー / 薬剤感受性 / プロテインチップ / オキサリプラチン / イリノテカン / 抗がん剤 / 個人差 / SELDI-TOF MS / MALDI-MS

薬剤の反応性には個人差(レスポンダー/ノンレスポンダー)がある。本研究では、がん薬物治療の個別化を目指し、タンパク質発現、細胞内代謝物の変動といった薬剤に対する生体反応の統合的解析による薬剤反応性指標マーカーを見出すことを目的とする。大腸癌治療におけるkey drugであるオキサリプラチン(L-OHP)、イリノテカン(CPT-11)、フルオロウラシル(5-FU)を対象に、ヒト大腸癌細胞株を用いたプロテオーム解析およびメタボローム解析を実施した。
1.オキサリプラチン感受性予測バイオマーカーの探索:11種類のヒト大腸癌細胞株のL-OHP感受性をIC_<50>値により評価し、各種プロテインチップを用いてSurface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(SELDI-TOF MS)により細胞内タンパク質の発現解析を行った結果、タンパク質発現強度(ピーク強度)と、L-OHP感受性(IC_<50>値)との間に強い相関性を示すバイオマーカー候補タンパク質を見出した。
2.イリノテカン治療反応性予測バイオマーカーの探索:各種大腸癌細胞株を皮下移植した担癌マウスを作成し、CPT-11に対するレスポンダー/ノンレスポンダーについて血清中のメタボロームの変動をキャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析計(CE-TOFMS)を用いて解析した結果、CPT-11曝露に起因して変動する血清中バイオマーカー候補化合物を見出した。
3.ヒト大腸癌細胞に5-FUを曝露させた後の内因性ヌクレオチドおよび5-FU代謝物のメタボローム変化をCE-TOFMSにて一斉解析し、5-FU曝露後の5-FU関連代謝物、核酸代謝の変化を含むメタボロームのダイナミクスを初めて明らかにした。

プロテオミクス / プロテオーム / マイクロアレイ / プロテインチップ / 蛍光ラベル / 相互作用 / ピューロマイシン

本研究は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という手順で行う。前年度は,これら各ステップについての基盤技術を,Fos-Junをモデルタンパク質としてほぼ確立できたので,本年度は,ラベル化およびマイクロアレイ化のハイスループット化を図るために,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行った.
まず,ポリコーム遺伝子群の中からRYBPおよびRipg1A,カルモジュリン結合タンパク質の中からミオシン軽鎖キナーゼ,カルシニューリン,カルスペルミンなどの遺伝子をクローニングし,GST融合タンパク質として小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成系で同時に平行してタンパク質を合成し,グルタチオンを塗布したスライドガラスに固定化した.この上に,蛍光色素Cy3とピューロマイシンが連結した化合物でC末端標識したRYBP, Ring1Aおよびカルモジュリンを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.このとき,様々な条件検討の結果,固定化するタンパク質の量は0.1mg/mlの濃度があれば未精製でも十分であり,また,固定化した後1週間経過してもスポットを検出することができたことから,スライドガラス上でタンパク質が安定に保存されることが分かった.
さらに,96穴および384穴マイクロプレートを用いたハイスループット化のモデル実験を行った.ストレプトアビジンにペプチドを付加した融合タンパク質を96穴および384穴マイクロプレートで多数,無細胞転写・翻訳し,ビオチンを塗布したスライドガラス上にスポットした.ペプチドに対する抗体および蛍光標識二次抗体を用いて,各スポットのペプチドを検出することに成功した.今後,ヒト完全長cDNAを用いて,タンパク質マイクロアレイの作成を行う予定である.

【研究分担者】
鈴木小夜	慶應義塾大学	医学部	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
土居信英	慶應義塾大学	理工学部	講師	(Kakenデータベース)