【研究分野】分子生物学およびその関連分野

【研究領域課題番号】17K19343 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

超解像度 / 金コロイド / ナノメートル精度 / ミオシン / 細胞 / 超解像 / モータータンパク質 / 金ナノ粒子 / 蛍光 / 金微粒子 / １分子計測

【研究成果の概要】

通常の顕微鏡で撮影した画像に対して超解像度を得る方法の開発を行った。骨格筋ミオシンフィラメントに顕微鏡の分解能以内に位置するミオシン２～３分子に金ナノ粒子（40nm）を結合し、高速カメラで金ナノ粒子をイメージングを行った。分解能以内にある複数の金粒子の位置を解析するために、Multi-Emitters Localization 法を用いて、各ミオシン分子の変位に分離することに成功し、アクチンと相互作用時の各分子の動態を0.1msの高時間分解能で計測することがきた。各分子はアクチンとの相互作用時において、10nm程度変位することが明らかとなった。また分子間の動きが同調している様子も観察された。

【研究の社会的意義】

従来の光の分解能を超える超解像顕微鏡が何種類も販売されている。しかし、従来の超解像法の共通した問題点は、画像取得速度が遅いことである。本研究では、この問題点を克服するために高速で超解像を得る顕微鏡の解析法を開発した。この方法によって通常の顕微鏡で細胞の画像を撮影した後に、超解像イメージング画像に変化できる。したがって、通常の顕微鏡の時間分解能で超解像を得ることができる。生物分野全般だけでなく、顕微鏡（や望遠鏡）を使う多くの分野が本研究課題の成果を利用することができるため、応用分野も広がっていくと期待される。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2017-06-30 - 2020-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究分野】分析化学

【研究領域課題番号】17H03075 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光 / 細胞 / 温度 / 分析 / イメージング

【研究成果の概要】

世界初となるカチオン性ラジカル重合開始剤を合成し、これを用いて無毒性のナノゲル状カチオン性蛍光性温度センサーを合成した。これにより、細胞分裂を含む長時間の細胞内温度計測が可能となった。また、開発した蛍光性温度センサーを利用して褐色脂肪細胞の分化の程度と熱産生能の関係を解明したほか、その熱産生にチャネルタンパク質であるパネキシン1が寄与していることも明らかにした。

【研究の社会的意義】

研究代表者は、世界で初めて蛍光性温度センサーを用いて、生きた細胞の温度計測を行った本分野の先駆者である。本課題の成果は、細胞内温度計測における蛍光性温度センサーの有用性を確固たるものにした他、生物学的・医学的にも興味を持たれている褐色脂肪細胞の熱産生メカニズムに迫ったものである。本成果を通じて、生物学や医学において細胞内温度計測技術が非常に有効であることを示すと同時に、幅広い分野の研究者に本法の重要性を伝えることができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】電子デバイス・電子機器

【研究領域課題番号】16K14256 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

集積回路 / 細胞 / イメージセンサ / 蛍光 / フォトニックデバイス / 細胞センサ / LSI / バイオデバイス

【研究成果の概要】

ヒスタミン応答細胞センサのマイクロフォトニック（μP）デバイス上への導入：ヒスタミン応答細胞センサの半導体チップ上での培養に成功した．ヒスタミン応答細胞センサはGFPが発現しており，これまでGFP蛍光検出用に研究室で開発した吸収フィルターを用いることで高い励起光除去比を得ることができる．今回接着層を工夫することにより高い確率での細胞培養に成功した．
ヒスタミン応答細胞を培養したμPデバイスの動作検証をPBS（Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝生理食塩水）中で動作を行った．ヒスタミン滴下によるGFPによる蛍光信号をμPデバイスを用いて検出することに成功した．

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】分析化学

【研究領域課題番号】15K13720 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

環状核酸 / 蛍光 / メモリ / 細胞 / モデル小動物 / イメージング / タンパク質 / 神経細胞

【研究成果の概要】

生体イオンや生体分子の濃度変動に対して忠実に蛍光シグナルを変化させるタイプの従来の蛍光プローブは、当該イオン・分子の細胞内動態の解明に大きく貢献してきた。しかし、特に生体（in vivo）での蛍光イメージングにおいては、その“忠実な応答性”が技術的に大きな制約を与えることがある。本研究では、従来の忠実応答型の蛍光プローブとは一線を画する全く新しいタイプの“メモリー型蛍光プローブ”を創製し、当該蛍光プローブが環状核酸に応答して大きく蛍光シグナルを生起することを示した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】15H03833 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光 / イメージング / 細胞 / 超高解像度 / タンパク質

【研究成果の概要】

本研究ではライブセル超解像イメージングの実現に向けて，今までにない全く新しいタイプの蛍光プローブの開発研究を行なった．青色光受容体のプロテインエンジニアリングに基づいて開発して蛍光プローブについて，実際にライブセル超解像イメージングにおける有用性を実証することができた．本研究によりライブセル超解像イメージングという新しい世界が実現し，様々な生命現象を極めて高い空間分解能で観察できるようになるだろう．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,030千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 3,930千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】24685027 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光 / 超解像 / プローブ / 細胞 / イメージング / 蛍光タンパク質 / タンパク質間相互作用 / 回折限界

【研究成果の概要】

本研究では，超高解像度でのタンパク質間相互作用の蛍光イメージングを実現するために，タンパク質間の相互作用が生起した時に初めて光活性化特性が出現する新しいタイプの蛍光プローブの開発研究を行った．さらに，生きた細胞で長時間の超解像イメージングを実現するために，青色光受容体のプロテインエンジニアリングや新しい近赤外蛍光タンパク質の探索研究を行った．

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】23655152 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体機能関連化学 / 生物発光 / 細胞 / 生体 / イメージング / プローブ / ルシフェラーゼ / ガン細胞 / 転移 / 可視化 / エネルギー移動 / 蛍光

【研究成果の概要】

本研究では,海洋生物である橈脚類(ガウシア・プリンセプス)由来のルシフェラーゼを出発物質として,超高輝度の変異体を論理的に開発した.ガウシアルシフェラーゼの酵素活性中心を推定し,部位特異的アミノ酸変異導入を行った.開発した変異体の中には,オリジナルのガウシアルシフェラーゼに比べて,10倍程度高輝度化した変異体や,スペクトルが33nm長波長化した変異体が含まれ,これらはバイオアッセイにおいて非常に有用なツールを提供する.この変異体の有用性は,BALB/cヌードマウスにおいて,当該ルシフェラーゼ変異体を発現するマウスB16メラノーマ細胞の肺への変異を高感度に可視化できたことでも明らかである.

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】分析化学

【研究領域課題番号】20685006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光 / 高分子 / 温度 / 分析 / 細胞

【研究成果の概要】

昨年度に開発した蛍光性温度センサーpoly (NNPAM-co-SPA-co-DBD-AA)を蛍光寿命イメージング法に応用し、COS7細胞内の温度マッピングを進めた。最初に、細胞内におけるpoly (NNPAM-co-SPA-co-DBD-AA)の性能について評価したところ、空間分解能200nm、温度分解能0.18～0.58℃であり、細胞内の温度分布イメージングが十分に可能であることが分かった。そこで実際に、生細胞内の温度を測定したところ、核や中心体が細胞質に対して有意に熱く、さらにその程度が細胞周期依存的であることが判明した。この細胞内における小器官の温度差はこれまでに報告がなく、本研究課題で開発した蛍光性温度センサーによって初めて捉えられた生物学的知見である。さらに、定常時においてミトコンドリア周辺で温度が高いことや、脱共役剤による刺激に応じてミトコンドリア周辺で顕著な温度上昇が起きることも確認した。現在、これらの成果を公表すべく投稿論文を執筆中である。
また本年度は、平成20年度に得られた細胞の温度測定に関する成果を43rd IUPAC World Polymer Congress (Glasgow, UK)にて発表し、さらにこれまでの蛍光性温度センサーに関する研究内容をInternational Congress on Analytical Science 2010 (Kochi, India)にて講演した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】25,740千円 (直接経費: 19,800千円、間接経費: 5,940千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】15750141 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / DNAzyme / 遺伝子 / アロステリック / 診断 / FRET / 蛍光 / 消光 / 遺伝子診断 / 細胞 / DNA酵素 / 細胞内遺伝子診断 / 大腸菌 / 薬剤 / スクリーニング

【研究成果の概要】

"細胞膜内における遺伝子検出・診断"を可能にするプローブとして、申請者は標的核酸をアロステリックエフェクターとする自己切断核酸配列(TASC)を提案してきた。まず、コンセプトとの実証に向けて、大腸菌rRNA-12MG1655 strainの16srRNAを標的としたTASCシステムをデザインし、in vitro系における遺伝子検出実験を行った。具体的には、5末端をフルオレセインでラベル化したTASCプローブを設計、合成し、16srRNA存在下における自己切断速度を求めた。その結果、従来のプローブデザインでは、標的非存在下においても、ある程度の自己切断が起こっており、細胞膜内における増幅型遺伝子検出に大きく影響を及ぼすことが予想された。そこで、標的核酸存在下における自己切断速度を軽減するため、TASCシステム中にヘアピンロック構造を形成する核酸配列を導入したLocked TASCプローブを新たにデザインし、この問題を克服した。実際にLocked-TASCシステムを合成し、その活性を測定したところ、およそ、20倍程度のON/OFF効率の上昇が見受けられた。
そこで、この改良型TASCプローブに5末端蛍光分子、鎖内消光分子(ダブシル)を導入したFRET型のLocked TASCプローブを設計・合成した。本プローブを用いた細胞外での確認実験のあと、パラホルムアルデヒドで固定化した大腸菌を用いた細胞膜内遺伝子検出実験を行った。その結果、細胞膜内における遺伝子検出、ならびに、細胞膜内におけるシグナルの等温増幅が確認された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)