【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】10460037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リン脂質 / ホシファテシジルイノシトールキナーゼ / 組織応答 / 分化 / アダプター / イノシトールリン酸 / MAPキナーゼ / ホスホリパーゼ / イノシトールリン脂質 / ホスファチジルイノシトール / ホスファチジルイノシトール3キナーゼ / 細胞応答 / 細胞増殖 / 細胞分化 / 増殖因子 / 分化因子

【研究成果の概要】

ホスファチジルイノシトール3キナーゼは生体内ではPIP_3を生じる。PIP_3は重要な2次メッセンジャーの担い手としていろいろな下流因子の活性化にあずかる。しかし、現在のところ多様なPIP_3の役割を説明するに十分な下流因子が同定されているとは言いがたく、本研究ではあらたなPIP_3結合タンパク質の性質の解明を行った。PIP3BPは核に存在するPIP_3結合タンパク質でArf-GAPと相同性があることから小胞輸送に関与していると考えられる。本年度はすでに同定したPIP3BP結合タンパク質BPキネシンを研究するため、モノクローナル抗体を作成した。また、一方ではあらたにSWAP70と呼ばれるタンパク質をPIP_3結合タンパク質として同定した。このタンパク質はB細胞特異的recombinaseのサブユニットと言われており、immunoglobulinのクラススイッチとの関係に興味がもたれる。SWAP70の局在を調べたところ、細胞質に限局していたが、活性型ホスファチジルイノシトール3キナーゼを共発現させたところ、核にも移行することがわかった。この移行はホスファチジルイノシトール3キナーゼ阻害剤に感受性であったため、PIP_3と結合することが核移行になんらかの役割を果たしていることが示唆された。また、SWAP70を昆虫細胞で大量発現させ、精製した。精製したタンパク質を用いて試験管内での核移行を検討した。その結果、試験管内ではSWAP70はATP依存性に核に移行することがわかった。この系を用いてのPIP_3の役割の検討が待たれる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】12,600千円 (直接経費: 12,600千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】10670128 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / チロシンりん酸化 / キナーゼ抑制因子 / JAB / SH2ドメイン / 細胞増殖 / 分化

【研究成果の概要】

サイトカインは受容体の細胞内ドメインに会合するJAKチロシンキナーゼを介して細胞内にシグナルを伝える。STATはそのシグナルを核へ伝える重要な転写因子のひとつである。われわれはSTAT5の負のフィードバック調節因子であるCIS1,JAKキナーゼの阻害因子であるJABをクローニング、さらにこれらを含むCISファミリーの存在を明らかにした。すでに培養細胞を用いて、CISは受容体に結合することでSTAT5を抑制し、JABおよびCIS3は直接JAKのチロシンキナーゼドメインに会合しその活性を抑制することを明らかにしてきた。
本研究においてはJABおよびCIS3のJAKシグナル抑制の分子機構を明らかにするために欠失変異や両者で保存されているアミノ酸に様々な点変異を導入し構造活性相関を行った。その結果CIS3のSH2ドメインはJAK2のactivatin loopに存在するY1007にSH2ドメインを介して結合することを発見した。しかしJAK活性化抑制にはSH2ドメインだけでは不十分で近接したアミノ酸約12個の部分が必須であり、この部分はJAB,CIS3でよく保存されている。この領域をキナーゼ阻害領域と名付けた。またこのN末端部分がないとJAKへの結合力が極端に落ちることからJAB,CIS3はSH2ドメインでactivatin loopと、さらにN末端部分でJAKの活性中心に結合していると考えられる。次にCIS3の生理機能を明らかにするためにCIS3ノックアウアトマウスを作成した。ノックアウトマウスは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5―15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07559018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 造血因子 / RAS / STAT / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 造血 / JAK / レトロウイルス / アポトーシス / サイトカイン受容体 / JAKキナーゼ / 転写因子 / 分化

【研究成果の概要】

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。
サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。
IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。
優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】05680618 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エリスロポエチン / 誘導遺伝子 / 受容体活性化 / プロモーター / 細胞増殖 / 分化 / シグナル伝達 / 受容体 / 情報伝達機構 / 活性化 / キメラ分子 / 分子生物学 / 細胞分化

【研究成果の概要】

我々はエリスロポエチン(EPO)受容体の活性化機構を解明する目的でチロシンキナーゼ型受容体(EGF受容体)の細胞外ドメインとEPO受容体細胞内ドメインのキメラ分子を作成しその機能を解析した。その結果キメラ分子はリガンド(EGF)に依存して2量体化し、細胞増殖および細胞分化(グロビンの合成)を誘導することがわかった。したがってエリスロポエチン受容体はリガンドに依存した2量体化によって活性化され、その細胞内ドメインに増殖分化のシグナルを発生するのに必要十分な機能がそなわっていることが明らかとなった。またEPO受容体の細胞内ドメインのC末端半分の約100アミノ酸残基を削ると、むしろ強く増殖や分化を誘導するようになった。したがって分化のシグナルに必須の領域はEPO受容体細胞内ドメインの膜に近い約120アミノ酸の範囲にあり、増殖のシグナルに必須の領域とオーバーラップしておりC末端半分はそれらのシグナルを負に調節していることになる。エリスロポエチン受容体からのシグナルによって誘導される遺伝子は細胞増殖や赤芽球分化を調節する重要な働きがあると考えられる。そこで我々はサブトラクション法を用いて、まずエリスロポエチン受容体によって誘導される遺伝子を複数クローニングした。今回SH2ドメインを有する新規遺伝子CIS(cytokine-inducible-SH2 protein)を発見しその機能解析を行った。誘導の分子機構を解析するためにプロモーター領域約1キロベースをクローニングした。今後転写活性化に必要なシスエレメントを同定し、そこに作用する転写因子を明らかにする。さらにCISは活性化されたEPO受容体やIL3受容体に会合することを明らかにした。今後CISを経由するシグナル伝達経路を明らかにし、またトランスジェニックマウスなどで生理機能を明らかにしたい。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】04454105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳腺 / レセプター / プロラクチン / インシュリン / MAPキナーゼ / 細胞増殖 / 成長因子 / 分化 / 乳腺上皮 / ホルモン / P34^<cdc2>キナーゼ / P32^<cdk2>キナーゼ / 分裂調節 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)