【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】17H03975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオ医薬 / 抗体医薬 / 安定性 / 凝集 / タンパク質 / 界面 / 免疫原性 / 分析 / バイオ医薬品 / 蛋白質 / 凝集体 / 質量分析 / 立体構造 / 抗体 / 免疫複合体 / TNF / 超遠心分析 / 沈降速度法 / 生体分子 / 薬学 / シグナル伝達 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

本研究によりバイオ医薬品で発生するタンパク質凝集体の定量的解析手法が確立し、凝集の原因となるストレスの特定に成功し、さらに凝集体の免疫原性との関連性について解明することができた。とくに、プレフィルドシリンジに塗布されたシリコンオイルとタンパク質が複合体となった際の免疫原性への影響は顕著であり、製剤における容器設計の重要性がより明確となった。また、従来から提唱されてきた、コロイド安定性と構造安定性に加えて、界面安定性の向上が凝集体発生の抑制には需要であることを示すことができた。さらに今回見出した振動や衝撃がタンパク質凝集を引き起こす点も医薬品の安定性を高める上で非常に有益であるといえる。

【研究の社会的意義】

本研究は、近年、利用されているバイオ医薬品の安定性と安全性に関するものであるが、これまで不明点が多かったタンパク質凝集体と副作用の関係を実験的に示唆することができた社会的意義の大きい研究成果である。特に、製薬企業から医療現場で利用される実際の場面へとフィードバックが可能な知見が数多く含まれており、かつ、応急処置的な対応では無く、包括的かつ根本的に医薬品の安定性を高めることが可能となることから、科学的意義は当然ながら、産業的意義が大きいといえる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,380千円 (直接経費: 12,600千円、間接経費: 3,780千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16K14495 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アミド化合物 / アミド結合形成反応 / ペプチド / アデニル化酵素 / 求核置換反応 / ポリリン酸キナーゼ / D-アミノ酸 / バイオプロセス / 芳香族カルボン酸アミド / 酵素 / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 生体分子 / 脂肪酸アミド / 生理活性

【研究成果の概要】

アミド化合物には生体分子や化成品など有用物質が多く、バイオプロセスによる効率的な合成法の開発が望まれている。研究代表者はカルボキシ基の酵素的アデニル化とアミンの求核置換反応によるアミド化合物合成法を開発している。本研究では本手法を拡張して合成可能なアミド化合物の多様化を検討した。Fatty acyl-AMP ligaseによる脂肪酸アミド合成法、非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメインによる芳香族カルボン酸アミド及びD-アミノ酸含有ジペプチドの合成法を開発した。また、ポリリン酸キナーゼを利用した単一酵素によるAMPからのATP再生系を構築し、アミド合成プロセスの低コスト化を達成した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16H04580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質工学 / 腫瘍免疫学 / 化学修飾 / バイオテクノロジー / コンパニオン診断薬 / がん免疫治療 / 個別化医療 / 生物工学 / 診断薬 / バイオマーカー / がん抗原 / 抗体検査 / 腫瘍免疫応答 / 蛋白質 / 癌 / 免疫学 / 生体分子

【研究成果の概要】

末梢血に含まれるがん抗原に対する自己抗体をバイオマーカーとして、個人差が大きいがんに対する免疫応答を的確に予測・モニタリングする技術開発に取り組んだ。150種類超の全長ヒトがん抗原の生産リソースを整備し、水溶性で全エピトープを露出するS-カチオン化抗原とluminex法を組み合わせた診断薬プロトタイプを完成した。実際にがん免疫サイクルの活性化を反映する自己抗体の変動を鋭敏に観察することに成功した。

【研究の社会的意義】

変性状態のタンパク質を可溶化する独自開発技術をベースとして、がん免疫治療をサポートできる診断薬開発が進捗した。腫瘍免疫応答は個人差が大きく現状では予測・評価が困難である。本研究で開発した自己抗体定量システムは、ごく微量の末梢血でがん免疫サイクルの活性化レベルを定量評価でき、治療方針の選択に活用できる可能性がある。本研究成果をベースに診断薬の実用化を加速したい。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】16K15212 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

非コードRNA / 蛋白質 / 機能性RNA / 核酸 / 細胞 / 生体分子 / バイオテクノロジー / プロテオーム

【研究成果の概要】

近年、miRNAやlncRNA等に代表されるノンコーディング(nc)RNAが、細胞内で核酸や蛋白質と相互作用して、多彩な生命機能の制御に寄与すること、また、その異常が疾病発症に関与することが明らかにされ、注目を集めている。しかし、個々のncRNAの機能に関しては依然として不明な点が多い。本研究では、ncRNAの機能解析に資する新たな基盤技術の確立を目指して、生細胞内でncRNAと特異的に結合する分子を網羅的に同定する実験法の開発に挑戦し、新規システムを樹立することに成功した。本法はncRNAに限らずmRNAの解析にも広く適用可能であると考えられ、当該分野の発展に大きく貢献することが期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】15H04189 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

合成生物学 / 進化分子工学 / スクリーニング / トリテルペン / オキシドスクアレン / 環化酵素 / 応用微生物 / バイオテクノロジー / 生物・生体工学 / 酵素反応 / 生体分子 / 微生物 / 生体機能利用 / 進化 / スクアレン / ホペン / スクアラン / ライブラリ / セレクション

【研究成果の概要】

30,000を超えると云われるトリテルペン類の全てが，スクアレンを原料として生合成される．これらの骨格形成に関わる未知の遺伝子探索と機能改良のため，不可視であった細胞内のスクアレンの消費活性を色スクリーニングする手法を開発した．この手法を用いて得たスクアレン環化酵素の活性変異体を用いた人工経路を構成し，自然界には見つかっていない種々の非天然トリテルペン合成経路を確立することに成功した．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26289318 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオテクノロジー / 遺伝子 / 酵素 / 生体分子 / 生物・生体工学 / ペプチド / アミド化合物 / 酵素工学

【研究成果の概要】

多様な機能を有するアミド化合物の中でも、抗体に代わる中分子医薬品として注目されているペプチドには、血圧降下作用をはじめ抗酸化や抗疲労さらには呈味性を有するものなど多く、効率的なペプチド合成法の開発が望まれている。研究代表者は、無保護のアミノ酸から任意のジペプチドを合成可能な新規酵素を多数取得しており、それらを利用して塩味増強効果を有するジペプチドの探索や酵素の機能改変による効率的な合成プロセスを開発した。一方、汎用性のあるアミド化合物の新規合成法も開発しており、合成可能なアミド化合物の多様性を拡張した。併せてAMPやADPからのATPの再生系を構築し、プロセスの低コスト化を達成した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】16,250千円 (直接経費: 12,500千円、間接経費: 3,750千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26289310 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / ナノ粒子 / DDS / 抗がん / 生体機能材料 / バイオテクノロジー / 生体分子 / ナノバイオ / 生体機能利用 / 蛋白質

【研究成果の概要】

疎水性温度応答性ポリペプチドとポリアスパラギン酸の融合タンパク質が、加温により直径30 nm程度の均一なナノスフィアを形成することが明らかとなった。このナノスフィアは、分子設計により表面に任意の機能タンパク質を提示することが可能であり、内部は疎水性コアを形成するため、疎水性化合物を容易に内包することができる。これを利用してがん細胞への特異的送達を行うため、表面に分子認識機能を有する分子を提示し、内部には抗がん剤を包含したタンパク質ナノスフィアを構築した。これらタンパク質ナノスフィアは、がん細胞を特異的に認識することができ、がん細胞に到達後は内部の薬剤を放出し殺傷できることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】15,990千円 (直接経費: 12,300千円、間接経費: 3,690千円)

【研究分野】分析化学

【研究領域課題番号】26620115 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体分子 / 1分子計測（SMD） / バイオテクノロジー / 細胞・組織 / 分析化学 / １分子計測(SMD) / １分子計測（SMD）

【研究成果の概要】

本研究では、生細胞内における目的RNAの動態解析と定量を同時に実現するRNA可視化蛍光プローブの開発を目指した。本プローブは円順列変位型蛍光タンパク質とRNA認識領域からなり、目的RNAの結合により蛍光性が変化するように設計した。RNA認識領域としてPUM-HD変異体を用い、マウス由来βアクチンmRNAをターゲットとした。本プローブをマウス由来細胞に導入し蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞質から明瞭な蛍光が観測できた。一方、RNAの有無による蛍光性変化、1分子検出感度での生細胞内RNA検出には不十分であった。以上より、今後はより高検出感度が期待できる二量体形成型蛍光タンパク質を採用する。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】分析化学

【研究領域課題番号】18350045 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

可視化 / バイオテクノロジー / 分析化学 / 生体分子

【研究成果の概要】

本研究では,蛍光タンパク質GFPとその誘導体,および発光タンパク質の一つであるルシフェラーゼを情報変換分子として,我々がこれまで開発した「タンパク質再構成法」を展開・応用し情報伝達分子の可視化法に関する研究を行った.ルシフェラーゼをプロテインスプライシングにより環状化した新たなプローブ設計の原理や,タンパク質間相互作用を時空間解析する分割ルシフェラーゼの開発など,新規なプローブ開発の概念を創出した.本成果は,生理機能の解明に大きく貢献することが期待できる.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】16,880千円 (直接経費: 14,600千円、間接経費: 2,280千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】17360393 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バイオテクノロジー / 生体分子 / 生物・生体工学 / 溶媒・添加剤 / アルギニン / 可溶化 / クロマトグラフィー / 凝集会合形成 / フィロールディング / 製剤 / プロテインマニピュレーション / リフォールディング

【研究成果の概要】

新規な蛋白質可溶化・調製法確立への,アミノ酸とその誘導体導入の具体的展開をさらに強固なものとするために,アルギニンとその誘導体の持つ蛋白質凝集抑制に関する作用機序の解明ならびに凝集体可溶化メカニズムへのアプローチについて,以下の観点から研究を進めた.
L-アルギニンとその誘導体の作用機序の解明:1)密度計を用いた溶解度測定によるL-アルギニン誘導体と各種アミノ酸,ペプチド結合との親和性の測定から,誘導体の性質によって,目的の機能向上が可能になることを示した.2)2種類の蛋白質のL-アルギニン存在下における結晶構造解析から,アルギニンが水和構造安定化に大きく寄与すること,蛋白質の高次構造にその作用機序が強く依存することを示した.
L-アルギニンとその誘導体を用いた蛋白質の可溶化:シグナル伝達系蛋白質数種類について,L-アルギニンとその誘導体を用いて発現した封入体の可溶化を試み,アルギニンの有用性を示すことができた.各種熱量測定からその安定性・機能の記述に成功した。以上の結果から,アルギニンとその誘導体を用いた蛋白質の可溶化法を確立した.
各種Chromatographyへの具体的展開:ゲルろ過(GPC),疎水的相互作用クロマトグラフィー(HIC),イオン交換クロマトグラフィー(IEX),色素親和性クロマトグラフィー(Dye),抗体を中心とした各種親和性クロマトグラフィーにおいて展開溶媒としてのアルギニンの有用性を確固たるものにした.
以上の結果から,アルギニンの持つ特殊な化学構造(グアニジウム基とアミノ酸)をたくみに利用することにより,蛋白質表面構造への作用機序を変化させ,汎用性の高い蛋白質ハンドリングに適用可能であることを示し,解析が困難な蛋白質に対する可溶化・調製システムの基盤を築くことができた.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,430千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】知能情報学

【研究領域課題番号】13680464 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNAコンピュータ / 分子計算 / 学習 / 生体高分子 / 超並列計算 / バイオテクノロジー / ブール関数 / オートマトン / 生体分子 / 無細胞タンパク質合成系 / 計算理論

【研究成果の概要】

分子計算理論の構築として,DNA分子の濃度とDNA計算中のノイズやエラーとの関係を調べて,理論的な解析を行った.具体的には,DNA分子の濃度を適切に調節することにより,ノイズに頑強な近似的アルゴリズムが構築可能であることを理論的に証明し,それに基づいて近似的アルゴリズムの設計方法を開発した(Sakakibara,2001).
帰納的学習アルゴリズムの設計として,ブール式の帰納的学習を効率よく行う分子計算アルゴリズムの開発した.具体的には,ブール式のDNA分子への符号化の方法と分子生物学実験操作を用いたブール式の評価方法を開発し,この方法とあわせてDNA計算の超並列性を用いることによって学習問題が効率よく解けることを示した(Sakakibara,2003).
さらに,無細胞タンパク質合成系を用いたまったく新しい分子コンピュータの方式を提案した(Sakakibara & Hohsaka,2003).この方式は,有限オートマトンという計算モデルをタンパク質合成系と拡張コドンを用いて実現し,試験管の中でその計算を実行する新しいタイプのDNAコンピュータを提案するものである.タンパク質合成系を用いることにより,従来のDNAコンピュータにおいて最大の問題となっていた,DNA分子の水素結合を用いたハイブリダイゼーションという演算による精度の低さとエラーの多さを解決することができる.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)