【研究分野】神経内科学

【研究領域課題番号】18590955 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小胞体ストレス / スタニオカルチン2 / アポトーシス / ノックアウトマウス / 老化 / アポトーシスソ

【研究成果の概要】

小胞体ストレス誘導遺伝子、スタニオカルチン2(STC2)作用を個体レベルで検討し、病態、特に老化での役割を明らかにするSTC2遺伝子改変マウスを作成し解析した。老化モデルKlothoマウスとの交配したところ、STC2ノックアウトによりKlohtoマウスの重要な表現型の一つである骨軟化症を軽減していた。STC2の重要な機能として骨代謝への作用がin vivoのレベルで示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2009

【配分額】4,450千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 750千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】17390089 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / RNA結合蛋白質 / KHドメイン / p53 / TGF-beta / エストロジェン / TPA / splicing / D8 / TGF-b / Bim / 3'-UTR / ノックアウトマウス / PNA

【研究成果の概要】

新規PNA結合蛋白質D8がアポトーシスを誘導する活性をもつことを見出しその分子機構を解析した。
1)D8はDNAストレスによるアポトーシズの誘導に重要な役割を果たしていることを見出した。
2)ルシフェラーゼ・アッセイ、クロマチン免疫沈降法によりD8のプロモーターがp53やTGF-betaシグナルにより直接に転写活性化されることを明らかにした。
3)D8がアポトーシスを誘導するためには、RNA結合活性をもつKHドメイン1,2両方が必要であった。
4)Bimの誘導がD8によるアポトーシス誘導に重要であることを明らかにした。
5)D8にエストロジェン受容体が結合し、mRNAのsplicingに関与することを示唆する結果を得た。
6)D8以外に染色体1,18,19に存在するファミリーを同定し、TPAによって発現誘導されることを見出した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】17390410 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨 / 骨密度 / Akt / 骨粗鬆症 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / ノックアウトマウス / アポトーシス / 軟骨 / 成長板 / 石灰化 / インスリン / 軟骨内骨化

【研究成果の概要】

本研究は、骨形成作用を持つインスリン/IGF-Iシグナルを細胞内で促進的に伝達するAktの骨代謝調節における生理的な役割・分子メカニズムを明らかにする目的で、Aktlホモノックアウトマウス(Aktl-/-)の解析を行い、下記の結果を得た。
(1)骨芽細胞や破骨細胞ではAktlの発現が最も優位であったことより、Aktl-/-マウスの骨格系に関する表現型を検討すると、海綿骨と皮質骨ともに骨量が減少していた。骨組織形態計測ではAktl-/-マウスでは骨芽細胞数の減少とともに骨形成が低下しており、TUNEL染色では骨芽細胞のアポトーシスが亢進していた。
(2)骨芽細胞の生存/アポトーシスにおいて、Aktlシグナルは、転写因子Fox03aをリン酸化してその核内局在を阻害することにより、ミトコンドリア経路のアポトーシス促進因子であるBimの転写・発現を抑制することによって、アポトーシス抑制的に作用していた。また、Aktlシグナルは骨芽細胞分化に必須の転写因子Runx2のDNA結合を促進することにより、Runx2を介する骨芽細胞分化と石灰化を促進する作用を持つことが示された。
(3)骨吸収を担う破骨細胞ではAktlが細胞自律的に分化と生存に促進的に働いていた。また、破骨細胞の形成を支持する骨芽細胞ではAktlがreceptor activator of nuclear factor-κB ligandの発現を促していた。
本研究により、Aktlは骨組織において骨芽細胞や破骨細胞の分化・生存を促進し、骨形成と骨吸収を正に制御しながら骨量を維持する重要な役割をはたしていることが明らかとなった。Aktlは生体内ではユビキタスに発現しており、機能も多彩であるため、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患の治療標的分子とはなり難いが、Aktlに関連する分子ネットワークのさらなる検索が骨疾患のより良い治療へと繋がるものと期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,310千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 810千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】15390100 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA結合蛋白質 / p53 / TGF-β / アポトーシス / Bim / KHドメイン / 標的遺伝子 / ノックアウトマウス / TPA / 発現誘導

【研究成果の概要】

p53およびTGF-βによって発現誘導される新規遺伝子D8を見出し、以下の事実を明らかにした。
1)D8をHepG2などの癌細胞に強制発現するとアポトーシスを誘導する。RNAiを用いてD8の発現を抑制するとp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導が阻害される。これらの結果から、D8はp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
2)5FU、アドリアマイシンなどによりゲノムの損傷をうけるとD8の発現が増加すること、これらの薬剤によるアポトーシスにD8が重要な役割をはたしていることを見出した。
3)BH3 onlyファミリーに属すBimがD8のKHドメインに結合することを見出した。RNAiを用いてBimの発現を抑制するとD8によるアポトーシス誘導が阻害されることから、BimはD8によるアポトーシス誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
4)D8はアポトーシスを誘導する活性のあるBimのmRNAを安定化することによりアポトーシスを誘導していると考えられた。
5)D8ノックアウトマウスの作成を進めた。
6)D8と相同性が高くドメイン構造も類似した3種類のタンパク質をコードする遺伝子(D8-2、D8-3およびD8-4)が存在し、D8ファミリーを構成していることを見出した。D8ファミリーの各cDNA全長を単離し全構造を明らかにし、ノックアウトマウスの作製を進めた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,400千円 (直接経費: 15,400千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】14570179 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CIZ / ノックアウトマウス / アポトーシス / 生殖細胞 / BMP

【研究成果の概要】

CIZノックアウトマウス(CIZ(-/-)マウス)において、男性不妊症の一つであるGermlnal-cell aplasia with focal spermatogenesisに類似した精巣の変性が認められていたため、以下の解析を行った。まず精巣内におけるCIZの発現部位を確認したところCIZは生殖細胞に発現しており、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞での発現は認められなかった。次に、TUNEL法を用いて精巣におけるアポトーシスの有無を調べたところ、CIZ(-/-)マウスの精巣では、アポトーシスを起こしている生殖細胞が増加していた。アポトーシスを起こしている細胞は、多くが一次精母細胞で、一部は二次精母細胞であった。精巣内でのアポトーシス亢進の原因としてセルトリ細胞の精子貧食能の増加が疑われたがCIZ(-/-)と野生型のセルトリ細胞で貧食能に差を認めなかった。一方CIZが、コラーゲンやマトリックスメタロプロテアーゼの転写を制御することやBMPシグナルを抑制することがこれまでに知られている。これらの異常がアポトーシス亢進の原因であるかどうかを調べるため、CIZ(-/-)マウスにおけるコラーゲンやマトリックスメタロプロテアーゼの発現を解析したが、いずれの発現分布もCIZ異なっていた。したがって、CIZ(-/-)マウスの精巣での表現形に関しては、コラーゲンやマトリックスメタロプロテアーゼの関与は考えにくい。一方、BMPシグナル関連では、Smad1の精巣内での発現部位を、免疫染色にて調べたところ、その発現はCIZを発現する細胞と一致した。また、文献上報告されているBMP8a,8bのノックアウトマウスの表現形はCIZ(-/-)マウスの表現形に近い。これらのことからCIZ(-/-)マウスの精巣における表現形は、CIZの欠損によりBMPシグナルに異常を来たすことが原因である可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13770114 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

EAT / ノックアウト・マウス / bcl-2 / 発生 / 初期胚 / 胎児性癌 / 胚性幹細胞 / アポトーシス / 分化 / 胎児性癌細胞 / 遺伝子ノックアウト法

【研究成果の概要】

EAT遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制することが示されている。本遺伝子のノックアウト・マウスは胚性致死であることが知られている。本研究では、さらにEATの発生段階および個体レベルでの機能を詳細にするために、マウスEC、ES細胞においてEATを欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、コンディショナル・ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行なうことを目的とする。
1.EATをコンディショナルにノックアウトするためのターゲッティング・ベクターを作製した。EATは、3ヶのexonからなるが、(1)exon1の両端にloxP配列を挿入したベクターおよび、(2)exon2の両端にloxP配列を挿入したベクターの2種類のターゲッティングベクターの作製を終了した。
2.上記ターゲッティング・ベクターをF9細胞、ES細胞に導入し、一方の対立遺伝子でexon1を挟むようloxP配列が挿入されたES細胞を10クローンを得た。現在これらのクローンを用いてマウスを作製している。
EATは初期胚発生過程のみならず、成獣の多くの臓器(主に上皮)で発現している。コンディショナル・ノックアウトマウスを作製し、成獣でEAT遺伝子をノックアウトすることにより、EATが機能している臓器やEATが果たしている機能が解明されると期待される。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)