Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

Mcl-1 / アポトーシス / siRNA

消化器癌細胞におけるアポトーシス感受性規定分子を検索し、Bcl-2ファミリー蛋白であるmyeloid cell leukemia-1(Mcl-1)が抗癌剤抵抗性克服のための標的分子となりうるか否かを検討した。胃癌細胞株(6種)を用い、Mcl-1発現レベルとアポトーシス感受性の相関を検討した。
Mcl-1 mRNA発現レベルはreal time PCR法により、Mcl-1蛋白発現レベルはwestern blot法により解析した。アポトーシス感受性感受性解析は、annexin V染色法、MTS assay、DAPI染色による蛍光顕微鏡観察を行った。アポトーシスの誘導は、抗癌剤(5-fluorouracil,cisplatin)、TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)を用いた。胃癌細胞株において、Mcl-1発現レベルとアポトーシス感受性の間に相関がみられた。Mcl-1発現抑制を誘導するため、ヘアピン型siRNA(shRNA)発現adenovirus vectorを作成し、高い遺伝子抑制効率を確認した。抗Mcl-1 shRNAベクターにより、著しいアポトーシス感受性増強作用が確認された。さらに、胃癌細胞株MKN-45を用いて、cancer stem cell-enriched fractionであるside population(SP)分画を分離したところ、SP分画においてより高いMcl-1の発現を認めた。さらに、抗Mcl-1 shRNAによりSP細胞のapoptosis感受性は増強された。これらの検討結果より、胃癌細胞に対する治療抵抗性克服のための分子標的治療において、Mcl-1が重要な標的分子となると考えられた。

テロメラーゼ / アポトーシス / 分子標的遺伝 / テロメクーゼ / 分子標的療法 / 優勢変異型hTERT / テロメスタチン / DNA damage / p38MAP Kinase / テロメア / 分子標的治療 / siRNA / G-quadruplex

造血器腫瘍の新しい分子標的療法を開発し、臨床的に効果のある治療法の開発を目指す。本研究では次世代型ABLチロシンキナーゼ阻害剤(dasatinib)とimatinibとの相乗効果の分子メカニズムをDNAマイクロアレイを用いて解析した。K562細胞をdasatinibまたはimatinibと共に培養後、DNAマイクロアレイにて誘導される遺伝子群について解析したところ、大多数の遺伝子は重複して抑制されていたが、dasatinibにて特異的に発現抑制が見られた遺伝子群の中でCDK2、CDK8を同定した。CDK2、CDK8 siRNAを用いることによりdasatinibとimatinibの相乗効果にCDK2、CDK8の関与が確認された。さらにThr315はBCR-ABLのキナーゼドメインの中心部に位置しており、ATP結合部位を覆っているため、ABLキナーゼ阻害剤に対てgatekeeperと呼ばれている。T3151変異型BCR-ABLはimatinib抵抗性Ph陽性白血病の約20%に認められる変異であり、第2世代型チロシンキナーゼ阻害剤、dasatinib及びnilotinibも無効であるため、有効な治療法は確立されていない。VE-465はATP競合型のAuroraキナーゼ阻害剤であり、BCR-ABL、Jak-2、Flt-3に対しても阻害効果を有する。本研究ではVE-465のWT BCR-ABL及びT315I BCR-ABLに対する生物活性を明らかにし、Ph陽性白血病に対する有用性を検討した。VE-465はp185BCR-ABL、T315IBCR-ABL共にキナーゼ活性をIC_<50>値2-5μMにて抑制した。VE-465、imatinib併用によりK562細胞においてアポトーシス誘導の増加、Caspase-3、PARPの活性化及びAkt、c-Mycの活性低下が確認された。VE-465はin vivoにおいてもT315IBCR-ABLキナーゼ活性を阻害し、BaF3 BCR-ABL移植マウスの生存期間を延長させた。

RNA干渉 / RNAi / siRNA / ヒト / マウス / 有効siRNA配列 / ウェブサイト / off-target / 遺伝子機能破壊 / 哺乳類 / 全ゲノム遺伝子 / RNA干渉法 / Dicer / eIF2C1 / インターフェロン / ヒトゲノム / 哺乳類培養細胞 / ds RNA / SiRNA / ルシフェラーゼ / アポトーシス

RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シーケンス時代の網羅的遺伝子機能破壊法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの変わりに用いられてきた。
我々は、はじめに、哺乳類におけるsiRNA依存的RNAiに、eIF2C1-4及びDicerが必要であり、これらのタンパク質がeIF2CのPIWIドメインを介して相互作用する事を明らかにした。次いでヒトやマウスの遺伝子機能解明をゲノムワイドで実施する上で問題となるsiRNA法の問題点、即ちランダムに設計したsiRNAのおよそ80%は役にたたないという問題にチャレンジし、それを実際的に克服する方法を見出した。内容の詳細は、発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時にみたしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNAの変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータをも知多解析から、ヒトやマウスのほとんど全ての遺伝子に有効なsiRNAが設計できることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNAの配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能かは異がかのうであることが分かった。良く効くsiRNA配列は、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。off target効果を最小にするコンピュータプログラムをコンピュータ科学の専門家(東京大学大学院新領域研究科・森下真一教授)との共同研究でつくり、最適siRNAを、投入した任意の配列に対してコンピュータで素早く応答するweb site (siDirect)を構築した。

【研究分担者】
樋口肇	慶應義塾大学	医学部	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
垣見和宏	東京大学	医学系研究科	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
程久美子	東京大学	大学院・理学系研究科	科学技術振興特任助教授	(Kakenデータベース)