Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

DNAトポイソメラーゼ / 遺伝子ノックアウトマウス / マウス初期胚 / ICRF-193 / RNAi / アポトーシス / カスパーゼ / HeLa細胞

研究代表者らが作出したDNAトポイソメラーゼIIα遺伝子ノックアウトマウスは、4細胞期で発生を停止するという表現型を示した。さらに、発生を停止した遺伝子ノックアウトマウス胚においては、見かけ上ふたつに分裂した核球の染色体DNAが、細いフィラメント構造により連結した形態をとっている。これらの発生停止胚は、抗PCNA抗体染色陽性で、かつ抗リン酸化ヒストン抗体染色陰性であった。DNAトポイソメラーゼIIαの阻害剤であるICRF-193で野生型胚を処理した場合にも発生が停止し、核球の形態異常がみられ、細胞は抗PCNA抗体染色陽性かつ抗リン酸化ヒストン抗体染色陰性であった。さらに、RNAi法によりHeLa細胞のDNAトポイソメラーゼIIαのメッセンジャーRNAを中和した場合にも、初期胚でみられたと同様の核の形態異常が認められた。これらの結果は、DNAトポイソメラーゼIIαの活性低下が生じると、G2期における染色体DNAの分離過程に異常が生じ、嬢染色体が完全に分離していないにもかかわらず細胞質分裂が進行してしまうことを示唆している。すなわち、このような状態における細胞においては、従来知られている細胞周期のチェックポイント機構は作動しないと考えられる。
さらに研究代表者らは、DNAトポイソメラーゼIIα遺伝子ノックアウトマウス胚、ICRF-193処理により発生を停止したマウスの初期胚、並びに、RNAiにより核の異常形態を引き起こしたHeLa細胞がアポトーシスを誘導することを見いだした。染色体分離異常を細胞がモニターし、カスパーゼ経路の活性化が引き起こされると考えられる。このアポトーシス誘導機構は、チェックポイント機構では排除しきれない異常細胞を個体から除去するために必要であると思われる。

RNA干渉 / RNAi / siRNA / ヒト / マウス / 有効siRNA配列 / ウェブサイト / off-target / 遺伝子機能破壊 / 哺乳類 / 全ゲノム遺伝子 / RNA干渉法 / Dicer / eIF2C1 / インターフェロン / ヒトゲノム / 哺乳類培養細胞 / ds RNA / SiRNA / ルシフェラーゼ / アポトーシス

RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シーケンス時代の網羅的遺伝子機能破壊法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの変わりに用いられてきた。
我々は、はじめに、哺乳類におけるsiRNA依存的RNAiに、eIF2C1-4及びDicerが必要であり、これらのタンパク質がeIF2CのPIWIドメインを介して相互作用する事を明らかにした。次いでヒトやマウスの遺伝子機能解明をゲノムワイドで実施する上で問題となるsiRNA法の問題点、即ちランダムに設計したsiRNAのおよそ80%は役にたたないという問題にチャレンジし、それを実際的に克服する方法を見出した。内容の詳細は、発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時にみたしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNAの変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータをも知多解析から、ヒトやマウスのほとんど全ての遺伝子に有効なsiRNAが設計できることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNAの配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能かは異がかのうであることが分かった。良く効くsiRNA配列は、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。off target効果を最小にするコンピュータプログラムをコンピュータ科学の専門家(東京大学大学院新領域研究科・森下真一教授)との共同研究でつくり、最適siRNAを、投入した任意の配列に対してコンピュータで素早く応答するweb site (siDirect)を構築した。

【研究分担者】
秋光信佳	東京大学	大学院・薬学系研究科	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
程久美子	東京大学	大学院・理学系研究科	科学技術振興特任助教授	(Kakenデータベース)