【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】21659350 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Bcl-2 family / 破骨細胞 / Bcl-2 / Mcl-1 / Bisphosphonate / Erk / Akt / Apoptosis

【研究成果の概要】

我々はこれまでにpro-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBimのノックアウトマウスでは破骨細胞の生存期間は延長しているが骨吸収活性は低下していること、一方anti-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBcl-xの破骨細胞特異的ノックアウトマウスにおいては破骨細胞の生存期間が短縮する一方で骨吸能が亢進していることを明らかにした。本年はあらたなBcl-2ファミリー分子であるMcl-1に注目して破骨細胞における役割を検討した。Mcl-1はBcl-2 familyに属する蛋白の1つであり、様々な細胞においてアポトーシスを抑制する働きを持つことが知られている。M-CSF,RANKL,TNF-alpha,IL-1等の添加によって破骨細胞におけるMcl-1発現の増加がみられ、さまざまな骨代謝疾患や炎症性疾患においてMcl-1が関与している可能性が示唆された。プロテアソーム阻害剤MG132添加によって破骨細胞におけるMcl-1の発現は上昇し、免疫沈降法によりMcl-1がユビキチン化されることが確認された。このことより、破骨細胞のMcl-1の代謝にはユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク分解系が関与していると考えられた。レトロウイルスやアデノウイルスを用いてMcl-1の発現量を増加させた破骨細胞の細胞生存能は亢進したが、骨吸収能は低下した。これとは逆にMcl-1の発現量をノックダウンやノックアウトによって減少させた破骨細胞の細胞生存能は低下し、骨吸収能は亢進した。以上の結果より破骨細胞においてMcl-1は細胞生存能に対しては正の制御を行うが、骨吸収能に対しては逆に負の制御を行う事が明らかになった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】20249064 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨 / 軟骨 / 筋 / 神経 / Bcl-2ファミリー / Bcl-xL / 破骨細胞 / TGF-beta / Cbl-b / RANTES / VICOM / Oligodendrocyte / 運動器 / 筋細胞 / アポトーシス / c-Src / Bc1-2 / RFN10 / apoptosis

【研究成果の概要】

「運動器」は動物の生命維持に必要不可欠な活動である「運動」を担う器官の総称であり、骨、軟骨および筋組織など直接運動に関与する組織、さらにはこれらの働きを調節制御する神経組織をも網羅する概念である。本研究では運動器を担う骨、軟骨、筋、神経の機能制御メカニズムをアポトーシス調節分子であるBcl-2ファミリー分子の役割を中心に解析した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2011

【配分額】46,540千円 (直接経費: 35,800千円、間接経費: 10,740千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】19592159 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ3 / 破骨細胞 / アポトーシス / 骨吸収 / 下顎前突症 / カスパーゼ / Caspase3 / 骨 / リモデリング / ミトコンドリア

【研究成果の概要】

アポトーシスとは、細胞の縮小や断片化、核の凝集と断片化といった形態的な特長を呈するあらかじめプログラムされた細胞死のことで、様々な分子間のシグナル伝達によるコントロールを受けている。そのなかでも、カスパーゼ3はシステインプロテアーゼの一種で、刺激により活性化されると、PARP(ADP-リボースポリメラーゼ)をはじめとするさまざまな細胞内基質を分解し、アポトーシスを誘導すると考えられている。骨形成を担う骨芽細胞は、骨細胞となり骨内に埋め込まれる際にその半数はアポトーシスすると考えられている。また、破骨細胞も骨吸収終了後に骨面から離れアポトーシスすることが示されている。骨系細胞のアポトーシスは骨組織における重要な代謝機構のひとつと考えられ、その調節を担うカスパーゼ3は何らかの関与をする可能性がある。そこで今回、カスパーゼ3遺伝子欠損マウスを用い、その役割を検索した。8週齢マウス頭蓋骨について肉眼観察及びX線撮影を行ったところ、遺伝子欠損型マウスの頭蓋冠はドーム状を呈し、眼耳平面と後頭蓋底前後径との交線は野生型に比べて鈍角となり、頭蓋の成長抑制が認められた。さらに、遺伝子欠損型では加齢に伴い頭蓋骨の膜性骨化の亢進と下顎前突症の所見が認められた。新生仔脛骨を通法に従い固定、脱灰後,パラフィン包埋による組織切片とし、TRAP染色を施したのち、顕微鏡にて破骨細胞の数を計測したところ、遺伝子欠損型では破骨細胞数の減少が認められた。この減少が骨芽細胞からの支持能減少に伴うものかどうかを検討するためにカルバリアより骨芽細胞を調整し、OPG mRNAの発現を検討した。遺伝子欠損型の骨芽細胞では野生型に比べ培養開始から、その発現量の増加が見られた。また遺伝子欠損型骨芽細胞のin vitroにおける石灰化亢進も認められた。アポトーシスを制御するカスパーゼ3の遺伝子欠損マウスでは、石灰化亢進を伴う頭蓋形成異常と、成熟破骨細胞数の減少を認めた。これらのことから、カスパーゼ3遺伝子は、骨芽細胞と破骨細胞のアポトーシス制御という面から、骨形成と骨吸収の微妙なバランスを保ち、正常な頭蓋の成長発育などを調整していることが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】18591652 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

破骨細胞 / アポトーシス / Bcl-2ファミリー / 骨吸収 / Bc1-2ファミリー

【研究成果の概要】

骨組織は破骨細胞による骨吸収とそれに続く骨芽細胞による骨形成が間断なく行われることによってその恒常性を維持している。骨代謝のイニシアチブをとっている破骨細胞は骨吸収を終えると速やかにアポトーシスに陥る。われわれはBcl-2ファミリーに属するアポトーシス促進分子Bimが破骨細胞のアポトーシスにおいて重要であり、骨吸収という機能調節にも大きな役割を果たしていることを報告した。しかし、Bcl-2,Bcl-xLなどのアポトーシス抑制分子による破骨細胞の生存・骨吸収能に対する役割については、未だに不明である。我々は、Bcl-2ファミリー分子を有機的分子複合体としてとらえ、Bcl-2、Bcl-2/Bim遺伝子欠損マウス、Bcl-xコンディショナルノックアウトマウスを作製し、破骨細胞のアポトーシス、骨吸収における役割を明らかにした。アポトーシス抑制分子であるBcl-2,Bcl-xLは、それぞれのノックアウトマウスのex vivoの実験により破骨細胞の生存に促進的に働いた。一方興味深いことに、骨吸収に関してBcl-2は促進的に、Bcl-xLは抑制的に作用していることが、ex vivoかつin vivoの実験で明らかとなった。また、Bcl-2のノックアウトマウスは腎不全、免疫系の異常を呈し、早期に死亡することが知られており、Bcl-2ホモノックアウトにBimヘテロノックアウトを加えたノックアウトマウスを作成し、Bcl-2の骨組織の役割を検討した。その結果、Bc1-2は成体マウスにおいて骨量を維持するのに重要であることがわかった。このようにBcl-2ファミリーは細胞の生死のみならず、その細胞固有の機能にづいても重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,980千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 480千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】17390410 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨 / 骨密度 / Akt / 骨粗鬆症 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / ノックアウトマウス / アポトーシス / 軟骨 / 成長板 / 石灰化 / インスリン / 軟骨内骨化

【研究成果の概要】

本研究は、骨形成作用を持つインスリン/IGF-Iシグナルを細胞内で促進的に伝達するAktの骨代謝調節における生理的な役割・分子メカニズムを明らかにする目的で、Aktlホモノックアウトマウス(Aktl-/-)の解析を行い、下記の結果を得た。
(1)骨芽細胞や破骨細胞ではAktlの発現が最も優位であったことより、Aktl-/-マウスの骨格系に関する表現型を検討すると、海綿骨と皮質骨ともに骨量が減少していた。骨組織形態計測ではAktl-/-マウスでは骨芽細胞数の減少とともに骨形成が低下しており、TUNEL染色では骨芽細胞のアポトーシスが亢進していた。
(2)骨芽細胞の生存/アポトーシスにおいて、Aktlシグナルは、転写因子Fox03aをリン酸化してその核内局在を阻害することにより、ミトコンドリア経路のアポトーシス促進因子であるBimの転写・発現を抑制することによって、アポトーシス抑制的に作用していた。また、Aktlシグナルは骨芽細胞分化に必須の転写因子Runx2のDNA結合を促進することにより、Runx2を介する骨芽細胞分化と石灰化を促進する作用を持つことが示された。
(3)骨吸収を担う破骨細胞ではAktlが細胞自律的に分化と生存に促進的に働いていた。また、破骨細胞の形成を支持する骨芽細胞ではAktlがreceptor activator of nuclear factor-κB ligandの発現を促していた。
本研究により、Aktlは骨組織において骨芽細胞や破骨細胞の分化・生存を促進し、骨形成と骨吸収を正に制御しながら骨量を維持する重要な役割をはたしていることが明らかとなった。Aktlは生体内ではユビキタスに発現しており、機能も多彩であるため、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患の治療標的分子とはなり難いが、Aktlに関連する分子ネットワークのさらなる検索が骨疾患のより良い治療へと繋がるものと期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,310千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 810千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】17659586 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨代謝 / 骨疾患 / アポトーシス / 破骨細胞 / BH3 / 歯周病 / 関節リウマチ / 炎症

【研究成果の概要】

[背景]硬組織の恒常性維持には、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスが重要である。一方、骨腫瘍、関節リウマチ、歯周病などの骨量減少病態においては、破骨細胞性の骨吸収が過剰であることが示されている。骨破壊病変部における骨吸収量は、破骨細胞数と単位破骨細胞あたりの骨吸収活性と強い相関をもち、また破骨細胞数は単位時間あたりに分化する細胞と、細胞死する細胞の比率に依存する。この観点から、破骨細胞の寿命に関する分子メカモズムを明らかにすることは、骨破壊病理の解明に重要である。
[初年度の解析]1、炎症性サイトカインによる破骨細胞の遺伝子発現変動解析。炎症環境下では破骨細胞がアポトーシス耐性になるということが報告されているため、作業仮説として、炎症性サイトカインの持続的な影響がアポトーシス抵抗性を説明するのではないかと想定し、これらのサイトカインがどのような経路を介してアポトーシス抵抗性を賦与するのかを明らかにするため、トランスクリプトーム解析を行った。現在、炎症性サイトカイン存在下で大きく発現変動した遺伝子の、破骨細胞寿命への関与を検討中である。2、遺伝子欠損動物を用いた解析。アポトーシス関連因子であるBimは、血清やM-CSF除去時の破骨細胞死に関与する。しかし生理的・病的条件下での細胞死への関与については未知である。そこでBimおよび同じくBH3 only familyに属するNoxa、Puma、並びにアポトーシスと関係深いp53を複合的に遺伝子欠損するマウスの作製を行った。現在、個体レベルでの骨形態計測と、上記因子を欠損する細胞のin vitro解析を進めている。現在は途中段階にあるが、上記の検討によって、いかなる因子が破骨細胞の寿命を担うのかを詳らかにできると考えられる。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】2,800千円 (直接経費: 2,800千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16390432 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

破骨細胞 / Rac1 / M-CSF / Akt / アポトーシス / 低分子量Gタンパク質 / アデノウイルスベクター / 骨吸収

【研究成果の概要】

破骨細胞は最終分化した増殖能のない細胞であり、一旦分化するとreceptor activator of NF-kB ligand(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)などの生存因子が存在しないと速やかに細胞死に至る。破骨細胞の細胞死はアポトーシスによるものであることが報告されている。アポトーシスは「プログラムされた細胞死」とも呼ばれ、細胞への様々な刺激、あるいはストレスなどによって誘導され、DNAの断片化を特徴とする静かな細胞死である。近年破骨細胞の細胞死はアポトーシスによることが明らかになってきたが、このように骨代謝の要ともいえる破骨細胞がなぜアポトーシスに陥りやすいのか、またその分子メカニズムはいかなるものか、などについてはほとんど明らかになっていないのが現状である。ビスフォスフォネートは強力な骨吸収抑制作用を有する骨粗鬆症治療薬であるが、その作用メカニズムとして破骨細胞のアポトーシス誘導が知られている。われわれはこれまでにsmall G proteinのひとつであるRasが破骨細胞の生存に重要であり、Rasの活性を抑制するdominant negative Ras遺伝子の導入によって破骨細胞は速やかにアポトーシスに陥り、Ras-ERK経路を活性化するconstitutively active MEK1の導入によってアポトーシスが強力に抑制されることを明らかにした。やはりsmall G proteinであるRhoファミリーに属するRac1はラメリポディアの形成などアクチン細胞骨格の制御に重要な働きをすると考えられているが、ある種の細胞ではアポトーシスシグナルに関与することが明らかになっている。われわれは破骨細胞のアポトーシスにおけるsmall G protein、なかでもRho,Rac,Cdc42といったRhoファミリーの役割を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】9,600千円 (直接経費: 9,600千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】15390450 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

破骨細胞 / アポトーシス / Bim / FADD / 骨吸収 / ユビキチン化

【研究成果の概要】

破骨細胞は生体では約2週間でアポトーシスによって細胞死に陥る、きわめて短命な細胞であるという事実である。換言すれば、骨リモデリングとは、破骨細胞によって急速に吸収され、欠損した骨組織を、骨芽細胞が緩やかに充填していく過程であるといえる。したがってリモデリングサイクルのイニシャティブをとり、骨代謝回転を決定しているのは破骨細胞であり、破骨細胞の活性、その生存期間は、生体において極めて厳密に制御されていなければならない。骨粗鬆症に代表される骨代謝疾患においては、正常なリモデリングの破綻、すなわち骨形成と骨吸収のアンバランスが大きな問題であると考えられているが、細胞レベルで主たる原因となるのは、破骨細胞の活性上昇・寿命の延長である。本研究においてわれわれは破骨細胞アポトーシスの分子メカニズムを検討した。その結果proapotptotic Bcl-2ファミリーに属するBH3-only protein Bimが破骨細胞アポトーシスに重要な役割を果たしていることが明らかになった。マクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)は破骨細胞アポトーシスを抑制するサイトカインであるが、破骨細胞をM-CSFで刺激するとBimがユビキチン化をうけ、プロテアソームによって分解される。このとき破骨細胞内のERKの活性化が重要な役割を果たす。今後破骨細胞におけるBimの発現を制御する薬剤を開発することによってまったく新しい骨代謝改善剤の開発がみこまれる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】11,800千円 (直接経費: 11,800千円)