【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】15K14228 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

合成生物学 / 制御 / 翻訳後修飾 / 進化分子工学 / プレニル化転移酵素 / イソプレノイド / カロテノイド / キナーゼ / スクリーニング / セレクション / プレニル化酵素 / 局在化 / 大腸菌 / バイオテクノロジー / 発現制御 / 生体機能利用 / 微生物

【研究成果の概要】

真核生物は，疎水的なプレニル基の付加によって，様々なタンパク質を膜周辺に局在化する機構を有する。本研究は，酵母プレニル化酵素Ram1/2系の大腸菌内で発現させ，タンパク質の局在調節機構の再構築を目的とした。自在なタンパク質の機能制御には至らなかったが，プレニル二リン酸に対するプレニル化酵素の基質消費活性スクリーニング系の確立, およびプレニル化システムによる転写抑制因子の細胞活性のオンオフ制御にむけた基礎的な知見の収集に成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】26460962 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大腸癌 / 大腸菌 / スクリーニング / 腸内細菌

【研究成果の概要】

大腸癌発生に関連すると報告されているコリバクチン陽性大腸菌について、本邦における保菌率や特徴について検討した。大腸癌症例のコリバクチン陽性率は43%、コントロールでは46%であり頻度、相対濃度に差を認めなかった。コリバクチン陽性患者の大腸癌ではk-ras遺伝子変異例が認められたのに対し、コリバクチン陰性患者ではk-ras遺伝子は全例野生型であった。ほか、局在、進行度、カプセル内視鏡所見などの臨床像には有意な差を認めなかった。これらの結果からは海外からの既報と異なり、本邦の大腸癌、とくにk-ras野生型大腸癌の発生にはコリバクチン陽性大腸菌感染以外のメカニズムが重要である可能性が考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】15750141 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / DNAzyme / 遺伝子 / アロステリック / 診断 / FRET / 蛍光 / 消光 / 遺伝子診断 / 細胞 / DNA酵素 / 細胞内遺伝子診断 / 大腸菌 / 薬剤 / スクリーニング

【研究成果の概要】

"細胞膜内における遺伝子検出・診断"を可能にするプローブとして、申請者は標的核酸をアロステリックエフェクターとする自己切断核酸配列(TASC)を提案してきた。まず、コンセプトとの実証に向けて、大腸菌rRNA-12MG1655 strainの16srRNAを標的としたTASCシステムをデザインし、in vitro系における遺伝子検出実験を行った。具体的には、5末端をフルオレセインでラベル化したTASCプローブを設計、合成し、16srRNA存在下における自己切断速度を求めた。その結果、従来のプローブデザインでは、標的非存在下においても、ある程度の自己切断が起こっており、細胞膜内における増幅型遺伝子検出に大きく影響を及ぼすことが予想された。そこで、標的核酸存在下における自己切断速度を軽減するため、TASCシステム中にヘアピンロック構造を形成する核酸配列を導入したLocked TASCプローブを新たにデザインし、この問題を克服した。実際にLocked-TASCシステムを合成し、その活性を測定したところ、およそ、20倍程度のON/OFF効率の上昇が見受けられた。
そこで、この改良型TASCプローブに5末端蛍光分子、鎖内消光分子(ダブシル)を導入したFRET型のLocked TASCプローブを設計・合成した。本プローブを用いた細胞外での確認実験のあと、パラホルムアルデヒドで固定化した大腸菌を用いた細胞膜内遺伝子検出実験を行った。その結果、細胞膜内における遺伝子検出、ならびに、細胞膜内におけるシグナルの等温増幅が確認された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)