【研究分野】細菌学(含真菌学)

【研究領域課題番号】20590452 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ガス壊疽菌群 / 毒素 / 構造活性相関 / コラーゲン結合ドメイン / 成長因子 / 骨新生 / 鼓膜閉鎖術 / 人工皮膚 / コラゲナーゼ / 上皮細胞成長因子 / 鼓膜穿孔 / 血管内皮細胞成長因子 / 血管新生 / 再生医療 / スピン標識ペプチド / 表皮成長因子 / 重層扁平上皮

【研究成果の概要】

「人喰いバクテリア」が産生するコラーゲン分解酵素は、コラーゲン細線維に結合する領域(CBD)をもつ。まずCBDの中で結合に直接関与する部位を明らかにした。次にCBDはコラーゲン分子の三重らせん構造が緩んだ部位を志向して一定の向きに結合することを示した。さらに、CBDの接続部はカルシウムを結合して構造が変わり、CBDの安定性と結合能が向上することを示した。最後に、CBDを用いて種々の生理活性物質を組織に結合させる新規の技術が種々の再生医療に応用できることを示した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】17650144 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

内皮細胞 / 毛細血管 / 再生医療 / 血管新生 / 内皮前駆細胞 / 低酸素 / コラーゲンゲル / バイオメカニクス / 基質 / コラーゲン / 足場構造

【研究成果の概要】

再生臓器の実現のためには、細胞集合体への酸素供給のための血管ネットワークが必要となり、特に3次元細胞組織中に深く侵入するような3次元のネットワーク形成が必要である。本研究では、3次元的に血管ネットワークが深く侵入する力学的刺激の最適条件、さらに内皮前駆細胞を用いた場合や、増殖因子(bFGF,VEGF)、低酸素による増殖誘導によるネットワーク形成の環境要因を明らかにする。特に18年度では、内皮前駆細胞の分化誘導の大きな潜在力を明らかにする。既に虚血部位に患者の骨髄から採取した内皮前駆細胞を注入すると、血管新生が著しく促進されるという再生医療による治療が行われている。従って、内皮前駆細胞は分化誘導の能力を十分に有していることが予想され、内皮前駆細胞に対して、力学的刺激が複合的に作用した際の毛細血管ネットワーク形成が促進される様子を明らかにした。
1.内皮前駆細胞の存在により毛細血管3次元ネットワーク形成が著しく促進され、前駆細胞からの液性因子の効果が明らかになった。
2.増殖因子の濃度勾配による促進効果については、濃度勾配により毛細血管ネットワークが深く侵入することが明らかになった。ただ、増殖因子の濃度勾配を維持することが困難でさらなる検討が必要である。
3.ゲルの硬さによる侵入深さへの影響:硬いゲルの場合、内皮細胞との相互作用の結果、毛細血管が深く侵入することが明らかになった。内皮細胞は、基質の力学的性質に極めて敏感であり、その結果として、毛細血管形成に大きな影響を与えることが分かった。
4.低酸素状態での液性因子の効果が極めて大きく、特に酸素の濃度勾配を与えることによって、大きく毛細血管3次元ネットワーク形成が促進されることが分かった。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】17390284 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 再生医療 / 血管新生 / 単球 / 脳梗塞 / 多能性細胞 / 血小板 / 皮弁

【研究成果の概要】

本研究では,申請者が発見したCD14^+CD45^+CD34^+I型コラーゲン^+のフェノタイプを持つ末梢血単球由来の多能性細胞(monocyte-derived Muultipotent Cell ; MOMC)を臓器再生のための細胞移植療法に用いるために必要な基礎研究を行った。
1)疾患モデルを用いたMOMC細胞移植による組織再生療法の確立
ラットの脳虚血,皮弁モデルを用いて同系MOMC移植による効果を検討した。ラット左中大脳動脈基部を1時間閉塞させた脳梗塞モデルでは,発症1週間後に経頭蓋的にMOMCを移植すると,対照のマクロファージまたは培養液のみを移植した群に比べてその後の神経学的機能評価で有意な改善を示した。一方,基部以外の血行を遮断した皮弁を作成した皮弁モデルでは,同系MOMC移植により,マクロファージ,線維芽細胞,培養液のみの移植に比べて生着面積が広かった。組織学的検討では,いずれのモデルでもMOMC移植群でのみ顕著な血管新生がみられた。GFP遺伝子導入同系ラット由来MOMCの移植実験により、移植したMOMCが血管腔に取り込まれ、血管内皮へと分化することを証明した。
2)細胞植に用いるヒトMOMCの至適培条件の確立
末梢血単球からMOMCへの分化にはα5β1インテグリンを介したフィプロネクチンとの結合と血小板由来の液性因子の両者が必須であることを明らかとした。候補分子解析から活性化に伴って血小板から放出されるSDF-1をMOMC分化誘導因子として同定したが、同時にTGF-βやPDGFなど分化抑制因子も存在することを明らかにした。従来の末梢血単球に血清+血小板を加える培養条件の代わりに、自己血漿にSDF-1のみを添加した培地で末梢血単球を培養することでMOMC分化誘導の最適化が可能であった。この培養系を用いることで大量の自己MOMCの調整が可能で、それらin vitroで増幅したMOMCを用いた再生医療の実現が可能となった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】15,400千円 (直接経費: 15,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】15209028 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヒトES細胞 / 再生医学 / 前駆細胞 / 内皮細胞 / 血管平滑筋細胞 / VEGF / ナトリウム利尿ペプチド / アドレノメジュリン / ES細胞 / 再生医療 / 血管再生 / 血管新生

【研究成果の概要】

1.ヒトES細胞からの血管前駆細胞の同定:
ストローマ細胞株(OP9細胞)と共培養することで、Flk1^+TRA1^-VEcadherin^-PDGFRβ^+の細胞が分化誘導され、この細胞群が血管前駆細胞(VPC)の特性を有していた。
2.血管ホルモンの血管再生作用の発現とその分子機構の解析-血管再生への応用
2-a.発生工学的手法によるナトリウム利尿ペプチドの血管再生作用の発見と遺伝子治療への応用:ナトリウム利尿ペプチド(NP)システムの種々の遺伝子変異動物およびアデノウィルスを用いた遺伝子導入により、NPの血管再生作用を発見した。2-b.アドレノメジュリンの障害内皮再生作用及び血管再生作用の発見とその分子機構の解析:NPと同様に血管拡張作用を有するアドレノメジュリン(AM)がcAMP/プロテインキナーゼAの活性化と、PI_3キナーゼ/Akt系の活性化により血管再生作用を発揮することを明らかにした。また、AM単独過剰発現トランスジェニックマウスを開発し、in vivoでのAMの血管再生作用を証明した。2-c.アドレノメジュリンによるES細胞由来血管前駆細胞からの内皮細胞分化誘導作用の発見:AMがVEGFと協調し、マウスES細胞由来VPCの内皮細胞への分化を強力に促進することを明らかにした。
3.ヒトES細胞由来血管前駆細胞の生体移植とその治療応用の検討:
ヒトES細胞由来VPCより分化された発生初期内皮細胞および血管平滑筋細胞の生体移植により、皮膚潰瘍モデルおよび閉塞性動脈硬化モデルにおいてヒト血管が効率よく構築され血流回復治療効果が認められた。
4.ヒトES細胞由来血管前駆細胞を用いたヒト血管発生分化関連遺伝子発現のジーンプロファイリングとデータベース構築:
ヒトES細胞由来VPCを用いて、マイクロアレイ法にてヒト血管発生分化誘導に関与する遺伝子群を網羅的に解析し、データベースを構築することを試みた。
5.マウスES細胞由来VPCの人工血管への播種と拍動流負荷による血管細胞への分化誘導の試み:
ポリウレタン性多孔性の生体移植用の人工基材を開発し、マウスES細胞由来VPCを回転培養にて播種し、拍動流負荷装置で還流刺激を加えたところ、VPCはずり応力により内皮細胞が分化し、さらに伸展刺激により血管平滑筋細胞が分化増殖した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】45,500千円 (直接経費: 35,000千円、間接経費: 10,500千円)