Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

１分子計測（SMD） / ナノバイオ / 蛋白質 / １分子計測（SMD) / 光ピンセット / リボソーム / １分子生理学・生化学 / １分子イメージング / ナノ計測 / １分子計測(SMD)

１．蛍光標識したmiRNA前駆体を細胞内にマイクロインジェクションし、内在性の生合成経路によりRISCに取り込ませた。ゴルジ体を中心にアクチンフィラメント上を動くmiRNAを１分子イメージングできた。
２．Cy5標識アンチセンスプローブを用いてストレス下の細胞内mRNAの局在を超解像イメージングした。ストレス顆粒（SG）内でmRNAは均一に存在するのではなく、直径約100 nmの高密度領域を形成していた。
３．SecMのリボソーム外の領域を部分的に欠損させた変異体の翻訳アレストの寿命を測定した。57-73と57-98番目のアミノ酸が翻訳アレストの安定化に寄与していた。

合成生物学 / 無細胞翻訳系 / リボソーム / tRNA / リポソーム / 構成的アプローチ / 試験管内再構成 / タンパク質 / ゲノム / 無細胞

本研究は、人工ゲノム構築に不可欠である関連遺伝子の追究から、それらの基盤技術の発展に貢献する研究である。本研究では、無細胞翻訳系中で複数種類のタンパク質が協働することで所望の機能が発揮される系の開発を行なった。特に、リボソーム関連遺伝子に着目したが、それ以外の遺伝子を用いた系の開発も行った。リコンビナントタンパク質を用いたリボソームの試験管内再構成系は、生合成因子を用いることで、よりリボソームの再構成効率が高い系を構築できた。また、リボソームの生合成過程における各因子の機能について新たな知見が示された。

リポソーム / ナノファイバー / 膜タンパク質 / ナノバイオ / バイオテクノロジー / 蛋白質

本研究の目的は、Acinetobacter sp. Tol 5細胞上の接着性ナノファイバータンパク質AtaAをリポソーム内部で合成し、表面に生やすことである。我々は、AtaAの基本構造を損なわずに正しくフォールディングされる縮小版ataAの遺伝子を作成し、無細胞タンパク質合成系でのポリペプチド鎖の合成を確認した。次に、縮小ataA遺伝子を細胞サイズのジャイアント・シングルラメラ・リポソーム内部で発現させ、縮小版AtaAタンパク質の合成とリポソーム表層提示を試みた。フローサイトメトリ－により、抗体蛍光標識した縮小版AtaAが極微量提示されている可能性が示されたが、確実と言えるレベルではなかった。

蛋白質 / リボソーム / 配列制御型合成 / 配列制御合成 / 核酸 / たんぱく質 / アミノ酸

細胞が利用する翻訳システムは配列が制御された生体分子(蛋白質)を合成できる画期的な分子機械である。本課題では、この蛋白質翻訳システムを利用した人工分子合成に向け、使用できる基質の拡張に向けた有機化学的アプローチを実施した。その結果、基質拡張に向けた指針を得るとともに、非天然基質の効率的利用に向けた新しい手法の開発に成功した。

リボソーム / ディスプレー / 蛋白質 / 相互作用 / 細胞 / 活性 / mRNA / 解析 / 試験管内進化 / 網羅的 / 非翻訳領域 / tRNA / 探索

天然型mRNAを荷札として用い、かつ、全長蛋白質を提示できる改良型リボソームディスプレー法の開発を目標とする。具体的には、終止コドンを読み飛ばし、その後に続く非翻訳領域をリンカーとして利用可能な改変翻訳系の構築を目指した。昨年度においては原核系翻訳システムにおけるコンセプトレベルでの具現化を実施、RNAの安定性、リボソームディスプレー後のRNA回収率から再構成蛋白質翻訳系を用いた改変翻訳系の構築を検討した。また、3種の終止コドンを効率的に読み飛ばすことが可能なサプレッサーtRNAの探索を行ない、サプレッション効率、また、3種の終止コドンに対する適応性の点からtRNAserを基本とする3種サプレッサーが本系の目的を満たすことを見出している(サプレッション効率向上のため、Release Factor非含有翻訳システムを利用した)。また、天然型と同じ配列の(かつ、様々な長さの)3'側非翻訳領域を有する擬似天然型Dihydrofolate Reductase mRNAを人工的に準備し、作成した改変翻訳系でのリボソームディスプレーを実施した。終始コドンより3末端側にT7-tagを組み込んでおいたところ、T7抗体によるタグ釣り上げが可能であり、この結果より、本系において終始コドンの読み飛ばし、3'-UTRのリンカーとしての利用が可能であることが示された。また、DHFRの配列を標的とする抗体を用いた実験も実施した。併せて、終結因子を取り除いた非再構成型タンパク質翻訳システムの調整を目的とし、RF1に対するRNAアプタマーを取得、サプレッション効率を上昇させる系の構築にも成功した。

【研究連携者】
岡部弘基	東京大学	大学院薬学系研究科	助教	(Kakenデータベース)
飯塚怜	東京大学	大学院薬学系研究科	助教	(Kakenデータベース)

【研究協力者】
木賀大介	早稲田大学	先進理工学部・電気・情報生命工学科	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
松浦友亮	大阪大学	工学研究科	准教授	(Kakenデータベース)