Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

分子マニピュレーション / 分子加工 / DNA / 分子操作 / 光ピンセット / ゲノム / バイオナノテクノロジー / 一分子操作 / ＭＥＭＳ / マイクロＴＡＳ

本研究は、生体分子を加工するツールを開発し、新たなゲノム解析技術へ応用することを目指す。本研究期間を通じて、光駆動微小構造体作製技術の確立と、微小構造へのタンパク質の固定化に取り組んだ。その成果として、自家蛍光を調節可能な微細構造の作製法を開発し、蛍光顕微鏡下で視認性の高い操作を実現した。また、光駆動微小構造体の基礎的な操作特性の把握を行い、作製効率や、光トラップによる発生力について新たな知見を得た。タンパク質の固定化に関して、表面プラズモン共鳴センシングによりマイクロ/ナノ構造へのタンパク質の固定化とタンパク機能の維持を実証した。

DNA / 単分子解析 / マイクロマニピュレーション / 光ピンセット / マイクロ流体デバイス / 単分子操作 / ゲノム / マイクロ液体デバイス / 高次構造

本研究課題においては、(1)狙った一つの細胞からMbオーダー(mmオーダー)のゲノムDNAを断片化することなく単離する。(2)単離したDNAの高次構造を制御し、単分子解析が容易な形態にして解析を行う。(3)解析後のDNAに対し、鎖上での空間的位置情報を押さえた上で興味ある塩基配列部分を回収する。という実験操作を全て顕微鏡下で連続的に行えるマイクロ流体デバイス開発を目指した、要素技術の確立を目的としている。
研究期間最終年度は、1)ゲノムDNAの展開固定および溶液環境を変化させてDNAの高次構造を制御するマイクロ流体デバイスの改良および、2)高次構造変化のメ力ニズム解明に重点的に取り組んだ。
1)ゲノムDNAの展開固定および高次構造の制御を行うマイクロ流体デバイスの改良
PDMSで成型した微細流路中のマイクロピラーにDNA懸架させて固定する方式は前年度と同様である一方で、ピラーアレイのレイアウトを最適化し、効率良く全長数百マイクロメートルのゲノムDNAを固定・展開することに成功した。また、流体の流速を圧力制御でコントロールする方式を採用し、より精度の高い流速制御を実現できるようにした。このデバイスを用いて、DNA凝縮剤を流し込んだところ、ゲノムDNAが凝縮する様子をリアルタイムで観察する事に成功した。また前年度と同様に高塩濃度溶液を流し込み凝縮剤の解離を行ったところ、DNAが脱凝縮する様子が同様に観察され、改良したマイクロ流体デバイスが十分に機能していることが確認された。
2)高次構造変化のメ力ニズム解明
ゲノムDNAが凝縮する際の挙動を、画像解析により定量的に調べた。その結果、凝縮の際にDNAファイバー上で起こる核形成・成長は、微細流路中を流れる凝縮剤溶液によって生じる流体力学的抵抗と相関のあることが分かった。

DNA / 高次構造転移 / 分子内相分離 / 光ピンセット / 蛍光顕微鏡 / スペルミン

DNA高次構造と生化学的活性の相関を、スペルミンの存在下でDNAが制限酵素によって切断されるかどうかを単分子レベルで調べる事により明らかにした。実験の結果、あるspermine濃度を境に、DNAが急激に制限酵素の切断を受けにくくなっていることが分かった。蛍光顕微鏡法を用いてspermine濃度に対するDNA分子の広がりを調べたところ、制限酵素の切断を受けにくくなるspermine濃度領域に対応して、DNA分子は広がった状態からコンパクトな状態へと変化していることが分かった。次いで、制限酵素ApaL Iによって切断される配列を持つ、88merの相補的オリゴヌクレオチドを合成し、spermine存在下で制限酵素による切断を行ったところ、短いDNAは高次構造変化を起こさないため、高濃度のspermine存在下でも相補的オリゴヌクレオチドは切断された。以上の結果から、高次構造変化を起こし得る程度に十分長いDNA分子は、DNA分子の凝縮転移に対応して、DNAが急激に制限酵素の切断を受けにくくなることが明らかとなった。また、Mbサイズの巨大DNAを細胞から浸透圧ショックによって取り出し、溶媒環境の異なる場へ光ピンセットによって搬送してDNA高次構造を制御するという操作を顕微鏡下で連続的に行うという実験を行い、単分子レベルの顕微鏡下での連続的な生化学実験の手法を提案した。

【研究連携者】
小穴英廣	東京大学	大学院・工学系研究科	准教授	(Kakenデータベース)
大平文和	香川大学	理事	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
鷲津正夫	東京大学	大学院・工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)
加畑博幸	京都大学	医学研究科	科学技術振興准教授	(Kakenデータベース)