Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

クロマチン / ヌクレオソーム / ベントDNA(bent DNA) / プロモーター / 転写調節 / DNA高次構造 / DNAフレキシビリティー / target-site selection / 機械的特性

代表的な二つの研究成果について述べる。
(1)真核生物遺伝子のプロモーターデータベースである"EPD(eukaryotic promoter database)"に公開されているヒトのプロモーターのすべて(1871種)を対象として、DNAのフレキシビリティーを解析した。その結果、TATAボックスもイニシエーターも共に上流側が"柔らかい"配列で構成され、下流側は"硬い"配列で構成されていることが判明した。また、同じ特性がマウスのプロモーターでも見られることが明らかになった。さらに、明確なシス配列を持たないプロモーターでは、転写開始点を中心とした数塩基対の領域がTATAボックスやイニシエーターの機械的特性と良く似た特性を有していることが明らかになった。
(2)負の超らせんを擬態した180塩基対の合成ベントDNA(T20)は、一過的遺伝子発現系、エピソーマルアッセイ系、クローン化細胞株を用いたステーブルアッセイ系のすべてでプロモーターを活性化できることが分かった。なお、クローン化細胞株としては、HeLa細胞ゲノムの様々な位置に1コピーのレポーターを組み込んだ6種の細胞株と、これらの株からT20を欠失させた6細胞株を用いた。さらに、エピソーム上またはクローン化細胞株のゲノムDNA上でT20領域に形成されるクロマチン構造を解析したところ、どちらの場合も、この領域には並進位相の異なる様々なヌクレオソームが形成されるが、各ヌクレオソーム上でDNAがとる回転上の位相は、すべて同じであることが判明した。以上から、プロモーター領域に結合したヒストンニアの移動をT20が助けることで転写が活性化する機構が考えられる。

クロマチン / ヌクレオソーム / ベントDNA(bent DNA) / プロモーター / 転写調節 / DNA高次構造

本研究では、まず、一過的に導入されたレポーター上に細胞核内で形成されるクロマチン構造を解析した。レポーターには、負の超らせんを擬態した176bpの人工ベントDNA(T20)をもつ単純ヘルペスウィルスtkプロモーター、T20をもつヒトhsp70Bプロモーター、ならびに左方向に緩やかにねじれた構造をとったマウスpgk-1プロモーターを用いた。T20は、我々が構築したベントDNAであり、細胞内でtkプロモーターを約100倍も活性化できる。今回、この系においてもプロモーター領域にヌクレオソームが形成されることと、強力なプロモーターとして知られるpgk-1プロモーター上にもヌクレオソームが形成されることが明らかになった。また、予備的ではあるが、hap70Bプロモーターの上流にT20を導入すると、"promoter-proximal pausing"が少し解除されることと、この現象に下流域のクロマチン構造が関与している可能性が示唆された。次に、レポーターをゲノムに1コピーだけ組み込んだ各種のHeLa細胞株を樹立し、解析を行った。その結果、T20をプロモーターの上流にもつ細胞株の場合、ヘテロクロマチン領域内でもプロモーターが活性化していることが明らかになった。
さらに我々は、ヒトのクラスIIプロモーターの中から、177のプロモーターを選定してコンピュータによる高次構造モデリングを行った。その結果、TATAボックスを含む領域には、正または負の超らせんを擬態したベントDMが高頻度に存在するが、転写開始点付近のらせん軸は多くの場合直線的であることが解明された。
以上の結果から、負の超らせんを擬態したベントDNAは、積極的にヌクレオソームを形成することで転写に寄与していることが示唆された。正の超らせんを擬態したベントDNAの場合、ヌクレオソームの形成を阻害して転写に寄与していると予想される。

ベントDNA(bent DNA) / プロモーター / 転写制御 / クロマチン / ヌクレオソーム / 転写(真核細胞) / 転写調節 / DNA高次構造

本研究では、人工合成したベントDNAとヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ(tk)プロモーターまたはヒトアデノウイルス2型E1A遺伝子プロモーターを用いて、50種類にものぼる組換え体を作製し、ベントDNAの形、プロモーターに対する回転上の配向、そしてその存在位置がプロモーターの活性に与える影響について、系統的な解析を行った。その結果、プロモーターを活性化できるベントDNAの形を解明し、加えて、プロモーターに対するベントDNAの最適空間配置も解明した。tkプロモーターの場合、TATAボックスの中心から上流に約140bp離れた位置に、左向きのねじれを持ったベントDNAの中心が存在すると(このとき、両中心は互いにほぼ反対向きの配置になる)プロモーターが最も活性化された。次に転写活性化の分子機構を解明するために、ベントDNAがプロモーター領域の局所的なクロマチン構造に及ぼす影響について解析した。その結果、再構成ヌクレオソームを用いたinvitroの解析でも、また、単離核を用いたin vivoの解析(in vivo DNaselフットプリントアッセイ)でも、高活性プロモーターにおいてのみ、TATAボックス上にヌクレオソームが形成されないことが解明された。これは、ベントDNAが試験管内だけでなく、生細胞核内においてもクロマチン構造の構築に大きな影響を及ぼしたことを示している。一般に、ヒストンは高活性を示すプロモーターには結合しにくくなっていると予想されるが、ベントDNAを持つ高活性プロモーターでは、このような現象が実際に起きることが明らかになった。今回得られた結果は、ベントDNAによる転写調節が、真核細胞ではクロマチン構造の制御を介して行われることを強く示唆するものである。