Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

バイオ分析 / イメージング / 光操作 / 蛍光 / 発光 / ＲＮＡ / ＧＰＣＲ / スクリーニング / RNA / GPCR / 蛍光イメージング / アポトーシス / 生体材料 / 可視化

生細胞内の分子の素過程をネットワークとして理解するために，生体分子を可視化および操作するための新たな分析方法を確立した．具体的には，１）小数生体分子の可視化・定量法，２）光による酵素活性制御法，３）Gタンパク質共役受容体活性を制御する光操作法を開発した．開発した方法は，基礎生命科学研究の基盤技術になるとともに，医学や農学や創薬分野等における革新的技術となる．

本研究では，個々の分子反応の素過程を追究する分子科学と，要素還元的に現象の解明を試みる生命科学との中核に位置し，分野横断的な研究領域を開拓する新規分析法を創出した．成果は国内外に情報発信を行い高い反響を得てきた．実際，国内外の異分野の研究者と共同研究が進んでおり，これまでに海外共同研究の成果として18件のoriginal papersを報告している．またプローブや光操作ツールのmaterial供与を国内外の研究者から依頼され，これまでに40件以上の研究者に遺伝子を供与してきた．さらに国内外での技術指導を積極的に展開することにより，開発した技術は分野の垣根を越えて大きな波及効果を生み出している．

RNA / 可視化 / タンパク質

本研究におけるRNA光制御の原理では、KillerRedから光照射によって発生する活性酸素がそれら阻害タンパク質を不活性化することで翻訳を開始させる。阻害タンパク質の結合領域付近にKillerRedを近接させるために、KillerRedタンパク質両端にそれぞれPum1HDを融合させたプローブを作製した。実際に培養細胞ヘプローブベクターを導入し,その発現をImmunoblottingおよび蛍光観察にて確認した。次に、光照射によってKillerRedからROSが発生するかどうかを顕微鏡下で確認した。まず、ROSを専用の蛍光検出試薬で検出した結果、ROSの増加を示す指示蛍光色を示した。また、プローブ導入済の細胞に特定波長の光を照射した結果、大きくKillerRed赤色蛍光が減衰した。この蛍光は数時間放置すると回復することから、ROSが正常に発生しプローブタンパク質自身を不活性化したと推察される。
一連のプローブ機能を検査するためのレポーター遺伝子として、発光タンパク質ホタルルシフェラーゼ遺伝子配列を用いた。この遺伝子配列上流に、KillerRedプローブの結合領域となる特定のRNA配列を設計し連結した。RNA配列にRNA検出プローブが特異的に結合することを、免疫沈降法を用いて確認した。
mRNAからの翻訳を通常状態において抑制するために、特定の阻害タンパク質が結合して翻訳を抑制するよう、プローブ結合配列のさらに上流に阻害タンパク質結合配列を連結させた。遺伝子発現が抑制されることをルシフェラーゼの発光値を時間経過的に測定することにより確認した。今後光照射による翻訳誘導の最適化を検証する。

【研究分担者】
尾崎倫孝	北海道大学	保健科学研究院	教授	(Kakenデータベース)
山口博之	北海道大学	保健科学研究院	教授	(Kakenデータベース)
芳賀早苗	北海道大学	保健科学研究院	博士研究員	(Kakenデータベース)