【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】17K07448 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 転写制御 / 分子認識 / GRASファミリー / 結晶構造解析 / IDDファミリー / 転写因子 / タンパク質間相互作用 / パターン形成 / 蛋白質 / 生体分子 / シグナル伝達 / 植物 / 発現制御

【研究成果の概要】

植物の根の形態形成に関与するGRASファミリーと転写因子IDDファミリーの相互作用に着目して、構造生物学的・生化学的手法を用いてより詳細な転写制御の分子機構の解析を行った。GRASファミリーのSCL3とIDDファミリー複合体のX線結晶構造解析を行った結果、既存のGRAS-IDD相互作用とは異なる新規の相互作用であることが明らかとなった。また、生化学的な解析から転写因子IDDファミリーとGRASタンパク質の組み合わせによって多数のタンパク質から構成される複合体が形成され、複雑な転写制御が行われている可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

植物の根の形態形成は成長過程と調和して転写制御をオン・オフにするため、複雑に制御されている。本研究では根の形態形成に重要な2つのファミリーGRAS, IDDファミリーについてその立体構造解析と分子相互作用解析の結果から、GRASファミリーとIDDファミリーの相互作用様式には多様性があることを示し、結合する組み合わせによって様々な転写制御複合体を形成し得ることを明らかにした。本成果は植物の複雑な転写制御機構の理解を深めると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】有機化学

【研究領域課題番号】15H06357 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘテロ環導入インダンジオン二量体 / 結晶構造解析 / 外部刺激応答性 / 異方圧応答性 / インダンジオン / X線結晶構造解析 / クリスタルエンジニアリング / メカノクロミズム / 超分子化学 / 分子認識 / 構造・機能材料

【研究成果の概要】

本研究の結果、ヘテロ環導入型インダンジオン二量体に関しての合成手法をある程度確立することが出来、これまでに4-ピリジル基、2-ピラジル基、2-チエニル基、3-メチル-2-チエニル基を導入したインダンジオン類とその二量体の合成に成功した。これらの結晶構造解析を行い、異方圧応答性を実現する上で重要な開裂活性C-C結合の平行化に成功した。また、4-ピリジル基導入体について加熱・冷却に基づくC-C結合の開裂・再結合と見られる挙動を確認した。さらに、4-ピリジル基導入体が分子性の細孔性結晶を形成したことは予想外の結果であり、分子認識・吸着材料としての展開も可能となった。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2015-08-28 - 2017-03-31

【配分額】2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】25440025 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 分子認識 / 転写因子 / GRASファミリー / IDDファミリー / 転写制御 / 根のパターン形成 / タンパク質複合体 / タンパク質相互作用 / パターン形成 / BIRD/IDDファミリー / 植物形態形成 / 分子複合体 / 結晶構造解析

【研究成果の概要】

植物の根の内部構造を決める2つのタンパク質SHRとSCRが、転写因子JKDと形成する三者複合体構造を決定した。SHRとSCRはヘテロ二量体を形成し、SHRの凹んだ溝にJKDがはまり込んでいた。このSHRに識別されるJKDの配列をSHR結合モチーフと命名した。JKDとよく似た転写因子は16種類あり、BIRDファミリーと呼ばれる。この中の13種がSHR結合モチーフをもち、SHR-SCR複合体と結合することがわかった。このことから、これらの相互作用を通してSHR-SCR複合体が複数の転写因子からなるネットワークを活性化することで、根の内部構造形成に必要な遺伝子を活性化する分子メカニズムが解明された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23770119 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 分子認識 / 積荷輸送 / ミオシン / 微小管 / 細胞内輸送 / 積荷認識 / 軸索ガイダンス / モータータンパク質 / 結晶構造解析 / 分子複合体 / 積み荷認識

【研究成果の概要】

モータータンパク質ミオシンによる積み荷輸送は，タンパク質やオルガネラを適切な場所へ運び，細胞での配置を規定するために不可欠なプロセスである．本研究では重要なミオシンの１つmyosin-Xについて、積荷輸送に関与する領域の構造を、積荷分子の１つである軸索ガイダンスに関与するDCCとの複合体として決定することに成功した。また、別な積荷分子インテグリンや微小管との相互作用解析の結果、myosin-Xは積荷分子ごとに異なる認識機構を持つことによって、多様な分子と特異的に相互作用することを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バクテリオファージ / 分子機械 / 分子認識 / 分子集合 / 感染 / 超遠心分析 / X線結晶構造解析 / 微生物 / 超分子構造 / リゾチーム / テイルリゾチーム / 収縮姓尾部 / 感染機構 / バクテイオファージ / T4ファージ / プロセッシング / 蛋白質工学 / T4類縁ファージ / βヘリックス

【研究成果の概要】

本研究は、バクテリオファージの収縮性尾部を対象として、ナノマシーンとしての尾部の分子集合機構および作動原理を分子・原子レベルで明らかにしようとするものである。3年間の成果のうち、特に重要なものは以下の通りである。
パーデュー大学ロスマン教授のグループとの共同研究により、尾部収縮後の構造が電顕画像からの3次元像再構成によって明らかになった。収縮後の低分解能の電子密度にもこれまでに決定された7つの蛋白質の高分解能構造が無理なくあてはまったことにより、構造変化では個々のサブユニットの構造は大きく変化せず、主に配置変換によってマクロな構造変化が起こっていることが明らかである。さらに、この構造変化の主役を担っているのがgp10で、この蛋白質が長軸に関して回転することにより、それまでgp12(小尾繊維)に結合していたgp11が尾繊維(gp34)に結合することが分かった。
テイルリゾチームgp5はプロセッシングを受けて351残基目のセリンのC端で切断されるがこれをロイシンに置換したgp5は切断が起きないことが分かったので、この変異体を調整して構造決定を行うことが出来た。その結果、これまで明らかでなかった切断部位周辺の15残基の構造が明らかになり、また、隣のサブユニットから出ているペプチドが基質認識部位を占拠することによってリゾチーム活性を抑制している現象は切断の結果ではなく、切断以前に起こっていることが分かった。
T4類縁ファージKVP40のテイルリゾチームgp5の単離・性状解析およびgp27対応蛋白質の発見:テイルリゾチームgp5はリゾチームドメイン・C末端β-helixを含む特異な構造を有し、N末端ドメインでgp27と結合し、gp27を介して基盤と結合している。T4近縁のファージではgp5のドメイン構造は良く保存されているが、遠縁になるに従って類似性が低くなる。KVP40のgp5ではリゾチームが欠損している。このgp5をクローニング、発現、単離して、性状解析を行ったほか、通常のbalst検索では検出されないが、ORF334を候補と考えてクローニング・単離・精製を行ったところ、この蛋白質がgp5と強く結合することが確認された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】生物・生体工学

【研究領域課題番号】13450337 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / ファージ提示法 / 変異導入 / 自己抗原 / 結晶構造解析 / 発現系 / 分子認識 / 巻き戻しシステム / 抗原抗体相互作用 / 蛋白性抗原 / X線結晶構造解析 / 熱力学的解析 / 変異体 / 非共有結合 / 蛋白質間相互作用

【研究成果の概要】

本研究では、ヒト抗体ゲノム情報に基づき、(1)遺伝子レベルの多様性の創出、(2)抗体の分子認識能による安定な生体外選択、(3)選択された抗体の高効率な調製系を構築することにより、生体内の免疫系を凌駕するような新機能ヒト抗体分子調製系の構築を目標とした.研究期間中の研究成果は以下の通りである.1.遺伝子の多様性:マウス、ヒト由来抗体可変領域を特異的に増幅できるDNAプライマーを設計、その増幅条件を検討した.抗体可変領域への無作為変異導入法として、Error-pronePCR法をとりあげ、無作為変異導入が可能な条件を検討し、金属イオンと反応時間の調節が重要であることを見出した.2.選択:可変領域断片が抗原存在下で安定になる機構を用いた選択を確立した.EGF受容体特異的ならびにNK細胞阻害性受容体(KIR)特異的ヒト抗体,生分解性プラスチック表面,金表面特異的抗体の選択・調製に成功した.1.で述べた手法により、ヒト型化した抗体へ無作為変異を導入、標的分子発現細胞を直接用いた選択を試みることにより、数箇所への変異導入により親和性の顕著な上昇を見ることができた.また,BIAC0RE2000のフロー・リアルタイムモニターリングシステムを用いた,選択法を確立した.3.調製系:抗体・各種サイトカイン等の調製に関して、添加剤の効果を考慮に入れた巻き戻し法の改良を試みた.アルカリホスファターゼなどの酵素との融合あるいは2種類の抗体断片や免疫賦括剤(サイトカイン)との融合を試み、安定な調製系を構築した.モデル抗体の分子認識能を詳細に解析した.抗体調製に関する巻き戻しシステムの分光学的解析を行った.4.選択された抗体の高効率な調製系の構築と構造解析:(2)で得られたヒト抗体可変領域について,大腸菌の高発現系で可溶性分子として調製し、精密な結合定数を測定した.また、生分解性プラスチック表面特異的抗体の分子認識機構を明らかにした.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】14,400千円 (直接経費: 14,400千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】12780486 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗原抗体相互作用 / 蛋白性抗原 / X線結晶構造解析 / 熱力学的解析 / 分子認識 / 変異体 / 非共有結合 / 蛋白質間相互作用

【研究成果の概要】

蛋白質間相互作用をより深く理解するために本研究では、モデルとなる蛋白性抗原と抗体可変領域の相互作用を取り上げ、(1)疎水的相互作用、(2)静電的相互作用(塩橋・水素結合)、(3)局所的構造変化に関与するアミノ酸残基、そして(4)界面に残存する溶媒分子に着目し、変異導入を施した抗原あるいは抗体を用いた相互作用について、構造解析・熱力学的解析を中心とした精密解析を行い、抗原抗体相互作用における特異性・親和性がどのような因子によって創出されているかを明らかにすることを目的としている。今年度の実績は以下の通りである。
(1)変異抗体と野生型抗原複合体の結晶構造解析:(1)水素結合を欠損させた軽鎖変異体(L-Asn31Ala, L-Asn31Asp, L-Asn32Ala, L-Asn32Asp,L-Asn92Ala, L-Asn92Asp)、(2)水素結合を欠損した重鎖変異体(H-Ser52Ala、H-Ser54Ala、H-Ser56Ala)、(3)抗原との誘導適合に重要な役割を果たしている重鎖Tyr53の側鎖を欠損させた変異体(H-Tyr53Ala)と野生型抗原との複合体について、熱力学的解析を詳細に行ったほか、構造解析に相応しい結晶を得、これらの結晶構造を精密化し、得られた構造情報を基に、熱力学的パラメーターの変化との関連を議論することができた。(2)三者複合体間の界面における水分子の役割の考察:変異抗体(L-Tyr50Phe、L-Ser91Ala、L-Tyr93Ala)との野生型抗原との相互作用について、熱力学的に解析し、複合体について、構造解析にふさわしい結晶を作製、結晶構造を精密化し、得られた構造情報に基づいて、熱力学的パラメーターとの変化を議論できた。(3)重鎖軽鎖間相互作用の役割:ファージ提示法により機能変換を施した変異抗体について、変異抗原ならびに野生型抗原との複合体の結晶構造を明らかにし、重鎖軽鎖間相互作用の抗原特異性への寄与について深く議論できた。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)