Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

１分子観察 / フラビン / １分子分光 / タンパク質 / 光センサー / 光応答 / 酵素 / PAC / アデニル酸シクラーゼ / 光活性 / 低温顕微法 / 光センサータンパク質

生化学反応は複数の生体分子がつくる柔らかく複雑な系である。それにも関わらず、高い選択性で効率よく進む。このような反応には水素結合が関わっており、水素結合がつくるネットワークが、このような特異性を産み出していると考えられる。しかし、その実体はよく分かっていない。研究を困難にしている主な原因は、（１）反応に関わる水素結合以外にも無数の水素結合があるため、重要な働きをする水素結合を特定できず、（２）様々な準安定状態の平均が観測されるため、活性に重要な変化が埋もれてしまうからである。そこで、応募研究では、水素結合とタンパク質活性化の関係を研究するモデル系として、光活性化酵素(OaPAC, Oscillatoria acuminata Photoactivated adenylyl cyclase)を用い、そのクライオ１分子観察をおこなうことを目標としている。
本年度は水素結合状態を正しく知るための蛍光分子の開発をおこなってきた。その結果、Cy7に代表されるような近赤外蛍光性のシアニン色素を用いると、450 - 600 nmの波長領域の発色団の吸収スペクトルを発光励起スペクトルとして観測できることを明らかにした。OaPACへの蛍光標識が予想以上に難しく、来年度でOaPACの研究をまとめることが困難になってきたが、この系を用いて、OaPAC以外の光捕集系タンパク質の研究も同時におこなっていきたいと考えがえている。具体的には、これまで我々が１分子分光の実績があるLight Harveting Complexや、これまで観察をしたことが無いフィコビリソームなどである。どちらも天然状態で発色団を持っており、この発色団周りの水素結合に関する研究を行う予定である。

タンパク質 / １分子観察 / 低温 / 分光 / 構造 / 物理化学 / １分子分光 / インフルエンザ / 単一分子分光 / 分子分光 / 一分子計測 / プロトンチャネル / 光学顕微鏡 / 実験

温度1.5 Kに冷却した生体分子の三次元イメージングをするための１分子蛍光顕微鏡を開発した。この顕微鏡の特性をＱdotにより評価した。まず、この顕微鏡は635, 532, 405 nmのどの波長でも色収差なく使用することが可能であった。さらに、その焦点付近の光分布（点像分布関数）は理論値の1.2倍以下であった。これを用いて、２個の分子の位置決定精度（解像度）を見積もったところ、焦平面方向が3 nm、光軸方向が 18 nmであった。

タンパク質 / 結晶成長 / 格子欠陥 / その場観察 / 単位成長ステップ / 表面拡散 / レーザー共焦点顕微法 / 1分子観察 / レーザー共焦点顕微鏡

リゾチーム正方晶系結晶表面上の単位成長ステップ,個々のタンパク質分子,および結晶中の格子欠陥を,新規に作製したレーザー共焦点微分干渉顕微鏡,近接場1分子観察蛍光顕微鏡,および光散乱トモグラフィー顕微鏡を用いてその場観察し,下記の成果を得た.
1.流れの効果:強制流下で結晶表面の成長ステップの挙動をその場観察し,流れが結晶表面への不純物の輸送を促進し,ステップを顕著に束化することを見いだした.
2.結晶上での表面拡散:結晶表面近傍での蛍光ラベル化リゾチーム分子の拡散運動をその場観察,結晶表面近傍ではバルク溶液中に比べて拡散係数が4桁小さいこと,および結晶方位に応じて拡散係数に異方性が見られることを初めて明らかにした.
3.不純物タンパク質の吸着機構:リゾチームおよび共有結合性リゾチーム・ダイマーを蛍光ラベル化し,結晶表面への吸着過程をその場観察した.その結果,蛍光ラベル化リゾチームは選択的にステップに,そして蛍光ラベル化ダイマーはテラスにランダムに吸着すること,および吸着機構に応じてステップ前進速度の過飽和度依存性が異なることを見出した.
4.結晶中の格子欠陥:結晶を溶解させることなく,結晶中の転位のその場観察に成功した.また,結晶表面に付着した微結晶が母結晶中へ固相インクルージョンとして取り込まれると転移の発生源となり,インクルージョン直上に渦巻成長丘が発達することを見出した.さらに,結晶中の空孔や不純物粒子を起源とするマイクロ欠陥と考えられるコントラストのその場観察にも成功した.
5.総括:結晶表面でのタンパク質分子の表面拡散・吸着・脱離過程を初めて明らかにした.また,高品質結晶を成長させるためには,不純物タンパク質の吸着サイトに応じて最適過飽和度が異なること,流れは抑制した方がよいことを見いだした.さらに,成長している結晶中の主な格子欠陥のその場観察技術を確立した.

【研究分担者】
伊関峰生	東邦大学	薬学部	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
塚本勝男	東北大学	大学院・理学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
樋口秀男	東北大学	先進医工学研究機構	教授	(Kakenデータベース)