Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

シングルセル解析 / マイクロ流体デバイス / ゲノム

本研究では、1細胞ゲノミクスとマイクロ流体技術を活用して、環境試料に存在する微生物の素性を明らかにし、最適な培養法を設計する「ゲノムデータに基づく戦略的微生物培養プロセス」を開発する。「単離培養を繰り返し、新規・有用微生物のヒットを期待する」という古典的・労働集約的な方法に対して、我々が提唱する新法では、「新規・有用種の存在・特性を事前に検知し、培養条件を事前に最適化して対象物を釣り上げる」という合理的なアプローチを微生物培養に採用することを目的としている。対象試料中の微生物種の推定と培養法の最適化には、未培養微生物の全ゲノム情報の網羅的取得が求められる。そこで、代表者が開発した網羅的なシングルセルゲノム解析技術(SAG-gel)を基盤技術として用いる(Chijiiwa et al. Microbiome 2020)。
初年度は、シングルセルゲノム解析技術(SAG-gel)を改良して、一度に千個を超える微生物シングルセルゲノムデータを取得する手法を確立し、さらに生菌特異的なシーケンス技術(PMA-SAG-gel, Hosokawa et al. Sci. Rep. 2022)を開発し、目標を達成した。第２年度は、大規模シングルセルシーケンス技術の論文報告に向けて、手法の最適化とデータ拡充を進める。このほかに、シングルセルトランスクリプトーム解析技術へも展開する予定である。また、ここまでに確立したデータ取得技術を用いて、特定の微生物から単離・培養条件を推定し、微生物集団からの単離培養を試みる。これには標準的なプレート培養のほか、マイクロ流体デバイスを用いた培養も検討する。対象はおもに土壌細菌やヒト常在菌を予定している。

シングルセル解析 / NGS / ゲノム / １細胞ゲノミクス / マイクロ流体デバイス

環境に存在する微生物の99%は実験室で培養できない。これら未培養微生物の理解には、ゲノムの直接解析が有用である。特に、細胞１つからゲノム配列を解読する「シングルセルゲノミクス」は、多様な微生物集団から個別のゲノム情報を得られる点で有効だが、従来法ではゲノム解読精度に課題があった。本研究では、従来法では困難であった、細胞１つからゲノムを解読し、その配列情報を１本のコンプリートゲノムへと再構成する技術を開発し、ヒト腸内細菌でその有効性を実証した。

シングルセル解析 / ゲノム / トランスクリプトーム / マイクロ流体デバイス / 1細胞解析 / １細胞解析 / エピゲノム

１細胞単位で遺伝子の発現を解析する技術が普及し、データ蓄積が飛躍的に進んでいる。このなかで、次世代の解析法として必要とされるのは、細胞の多様性を生む原因と結果を知るための多階層の情報を統合的に解析する技術である。本研究では、(1)1細胞単位でゲノム中の遺伝子変異を解析する技術や、(2)組織観察像から任意の微小領域を選択し、微小組織を採集して抽出した微量な核酸から遺伝子発現やゲノム配列を解析し、組織中の領域情報と統合的に分析する技術を開発した。

ゲノム / DNA / マイクロ流体デバイス / バイオテクノロジー / マイクロ・ナノデバイス / シングルセル / エピジェネティクス

本研究において、我々は個々の細胞から染色体/クロマチンを単離し、エピゲノム解析するための新たな手法を開発した。即ち、顕微鏡下で細胞から染色体/クロマチンを断片化させずに単離し、溶液条件を制御することで染色体/クロマチンを解きほぐしてクロマチンファイバーとし、これを展開して直線状の形態を取らせる事のできるマイクロ流体デバイスを開発した。このマイクロデバイス内では、取り出した染色体/クロマチンに対する免疫蛍光染色が可能となっている。ここで開発した手法は、個々の細胞中のゲノムに対する後天的修飾について直接調べるという1細胞エピゲノム解析への応用が期待される。

DNA / 単分子解析 / マイクロマニピュレーション / 光ピンセット / マイクロ流体デバイス / 単分子操作 / ゲノム / マイクロ液体デバイス / 高次構造

本研究課題においては、(1)狙った一つの細胞からMbオーダー(mmオーダー)のゲノムDNAを断片化することなく単離する。(2)単離したDNAの高次構造を制御し、単分子解析が容易な形態にして解析を行う。(3)解析後のDNAに対し、鎖上での空間的位置情報を押さえた上で興味ある塩基配列部分を回収する。という実験操作を全て顕微鏡下で連続的に行えるマイクロ流体デバイス開発を目指した、要素技術の確立を目的としている。
研究期間最終年度は、1)ゲノムDNAの展開固定および溶液環境を変化させてDNAの高次構造を制御するマイクロ流体デバイスの改良および、2)高次構造変化のメ力ニズム解明に重点的に取り組んだ。
1)ゲノムDNAの展開固定および高次構造の制御を行うマイクロ流体デバイスの改良
PDMSで成型した微細流路中のマイクロピラーにDNA懸架させて固定する方式は前年度と同様である一方で、ピラーアレイのレイアウトを最適化し、効率良く全長数百マイクロメートルのゲノムDNAを固定・展開することに成功した。また、流体の流速を圧力制御でコントロールする方式を採用し、より精度の高い流速制御を実現できるようにした。このデバイスを用いて、DNA凝縮剤を流し込んだところ、ゲノムDNAが凝縮する様子をリアルタイムで観察する事に成功した。また前年度と同様に高塩濃度溶液を流し込み凝縮剤の解離を行ったところ、DNAが脱凝縮する様子が同様に観察され、改良したマイクロ流体デバイスが十分に機能していることが確認された。
2)高次構造変化のメ力ニズム解明
ゲノムDNAが凝縮する際の挙動を、画像解析により定量的に調べた。その結果、凝縮の際にDNAファイバー上で起こる核形成・成長は、微細流路中を流れる凝縮剤溶液によって生じる流体力学的抵抗と相関のあることが分かった。

【研究分担者】
西川洋平	早稲田大学	ナノ・ライフ創新研究機構	次席研究員(研究院講師)	(Kakenデータベース)

【研究連携者】
鷲津正夫	東京大学	大学院工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)
オケヨケネディ	東京大学	大学院工学系研究科	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
鷲津正夫	東京大学	大学院・工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)
加畑博幸	京都大学	医学研究科	科学技術振興准教授	(Kakenデータベース)