【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】22591008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / G タンパク質 / 機能選択性 / 疾患 / 制御 / G タンパク質共役受容体 / Gタンパク質 / Gタンパク質共役受容体

【研究成果の概要】

今後の薬剤開発において重要となるGPCRシグナルにおける機能選択性について、疾患の解析と受容体作動薬の作用から検討した。具体的には、生体内で機能選択的に作動するCa感知受容体に対する自己抗体の作用、部分尿崩症の原因となるV2受容体変異体に対する受容体作動薬の特異な作用、GPCRシグナルにおける機能選択的不活性化をターゲットとする薬剤や、クロストークの制御機構の解析をおこなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】19591073 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

レセプター / G蛋白質 / 活性化 / インバースアゴニスト / 局在 / Gタンパク質 / 受容体 / 分子機構 / 疾患 / Gタンパク質病 / 機能選択性 / G蛋白質病

【研究成果の概要】

疾患の原因メカニズムとして需要な、G蛋白質共役レセプターのアゴニストによらない自律的活性化のメカニズムを明らかにし、またその制御機構としてのインバースアゴニスト、レセプターとG蛋白質の共役を標的とする変異体シグナル分子の遺伝子導入、機能選択的活性化の効果をシグナル分子の細胞内局在変化を指標に解析した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】18580100 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物ステロイドホルモン / プロゲステロン / シロイヌナズナ / 胚軸伸長 / 7回膜貫通型タンパク質 / Gタンパク質 / mPR / 受容体 / 黄体ホルモン / Gタンパク質共役型受容体 / 情報伝達 / アラビドプシス / 細胞膜 / 7回膜貫通ドメイン

【研究成果の概要】

ステロイド骨格は類縁ながら側鎖形状が動物ステロイドホルモンとは異なるブラシノステロイド類に限られていると考えられていた。本研究では、動物ステロイドホルモンとして知られるプロゲステロンについて、プロゲステロン内部標準物質とGC-MS解析によって、イネとアラビドプシスにおいて、確かにプロゲステロンが内生することを明らかにした。さらに、エンドウ、トマト、ジャガイモ、リンゴなど様々な植物にも植物ホルモンと同程度の内生量で存在すること、また、主に未熟種子などで内生量が多いことから、植物においても生殖期に機能する可能性を示した。
続いて、シロイヌナズナを被験植物として、弱光および暗黒条件下における胚軸伸長に対するプロゲステロンの作用を調べた結果、プロゲステロンの伸長促進活性が明らかとなった。これにより、プロゲステロンが植物に内生するに留まらず、確かに生理機能を持ち、植物成長においても重要な機能を果たす活性化合物であることを明らかとした。
さらに、生理機能発現の第一段階として、プロゲステロン受容体の探索を行い、ヒトのプロゲステロン結合タンパク質に対する相同性遺伝子を3種類と、7つの膜貫通領域を有するGタンパク質共役型受容体(mPR)に対する相同性遺伝子を6種類得た。特にAmPR1遺伝子について解析を進め、AmPR1遺伝子破壊突然変異体においては、胚軸伸長が低下しており、また、AmPR1遺伝子産物は花器官で高い存在量を示すことを明らかとした。これらのことより、AmPR1が植物におけるプロゲステロン受容体である可能性が高いという考察結果が得られた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】4,010千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】17590955 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

G蛋白質 / GPCR / 分子機構 / 脱感作 / 疾患 / G蛋白質病 / レセプター

【研究成果の概要】

1)G蛋白質病の解析に基づくG蛋白質の脱感作メカニズムの解明:
G蛋白質病の解析は、GPCR・G蛋白質の作用機構の解明に貢献してきた。今回、新たなG蛋白質病の原因となるG蛋白質変異体(AVDT変異体)を解析し、G蛋白質レベルの脱感作機構に示唆を得た。
(1)GPCRシグナルの差異と脱感作:G蛋白質の細胞内局在を細胞間で比較検討し細胞特異的な脱感作の分子メカニズムにG蛋白質の可逆的な脂質修飾が関与する可能性を示した。
(2)G蛋白質レベルの脱感作:関与するpalmitoyl-esteraseの過剰発現によってシグナルの抑制と相関するGs局在変化が生じることを明らかにした。
2)新しいレセプター・G蛋白質シグナル調節機構と病態への関与:
(1)脱感作制御分子の遺伝子導入:レセプター・G蛋白質シグナルの脱感作に対して、GRK、arrestin、Gtの遺伝子導入とシグナル分子の局在変化の相関を検討した。
(2)シグナルスイッチング:Ca感知受容体(CaSR)のシグナル変化を原因とする新規の疾患であるacquired hypocalciuric hypercalcemiaで新たなCaSR自己抗体を発見した。この自己抗体は、CaSRに対するallosteric modulatorとして作用し、本来GqおよびGiと共役するCaSRをGqのみを活性化するユニークな活性型に維持し、シグナル特異性のスイッチングという制御を行っていることを明らかにした。今後、類似疾患の解明とあわせて、GPCRのシグナル特異的な制御機構の解明への示唆が得られると考えられる。
(3)AT1を端緒としてGPCRに対するインバースアゴニスト作用の薬剤における意義を検討し、薬剤スクリーニングをおこなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】2,700千円 (直接経費: 2,700千円)

【研究分野】生物生産化学・応用有機化学

【研究領域課題番号】14206015 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ジベレリン / ジベレリン結合タンパク質 / ジベレリン受容体 / アズキ / GA2-oxidase / GID1 / 受容体 / Gタンパク質 / GA 2-oxidase

【研究成果の概要】

アズキ黄化芽生えのジベレリン結合活性を示すタンパク質を精製し、20万倍以上の濃縮を達成し、その性質を解析した。このジベレリン結合タンパク質は、活性型ジベレリンのGA_4にたいし、Kd値が10^<-7>Mオーダーの高い親和性を示すとともに、同じく活性型ジベレリンであるGA_1, GA_3に対する親和性もGA_4の10〜20%と高いものであった。一方、GA_4の生合成前駆体であるGA_9や不活性型の3-epi-GA_4に対してはほとんど結合活性を示さず、基質特異性、親和性からジベレリン受容体としての性質を満足していたが、完全な単離には至らず、そのアミノ酸配列を明らかにすることはできなかった。一方、活性型ジベレリンの代謝酵素が同様な基質特異性を示す可能性を検討した。アズキ黄化芽生えに発現しているジベレリン不活性化酵素GA2-oxidaseは3種類あり、その中のVaGA2oxA1は、Co^<2+>存在下でGA_4に対し高い結合活性を示したが、GA_9にも結合活性を示した。さらに、抗VaGA2oxA1抗体を調製し、精製を進めたジベレリン結合タンパク質との交差生を調べたところ、全く交差しなかったことから、ジベレリン家結合タンパク質はGA2-oxidaseとは異なった。本研究期間中に、ジベレリン受容体の特定には至らなかったものの、本研究の成果は、その後、ジベレリン非感受性矮性イネ変異体gid1の原因遺伝子GID1のコードするタンパク質がジベレリン受容体であることを実証するうえで、多大な貢献を果たした。後に、アズキのジベレリン結合タンパク質がイネのジベレリン受容体OsGID1に対する抗体と交差したことから、アズキのジベレリン結合タンパク質は、GID1のホモログであると考えられた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】52,260千円 (直接経費: 40,200千円、間接経費: 12,060千円)

【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】14207044 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

G蛋白質 / レセプター / 分子機構 / G蛋白質病 / 遺伝子治療 / 脱感作 / 心肥大 / インバースアゴニスト

【研究成果の概要】

1)G蛋白質病解析に基づくG蛋白質の作用メカニズムの解明:
我々は、レセプターによるG蛋白質活性化モデルを提唱してきたが、(1)新しいG蛋白質病で発見されたAVDT変異体を解析し、自体シグナルに対し抑制的に作用することを明らかにした。(2)αとβγの相互作用に関与する変異体を解析した。
2)新しいレセプター・G蛋白質シグナル機構と病態への関与:
(1)メカニカルストレスにより、AT1レセプターがアンジオテンシンII非依存性に自立的に活性化されることを明らかにした。(2)ある種のAT1レセプターブロッカーがインバースアゴニストとして作用することによって、この自律的活性化を抑制することを明らかにした。新しいレセプターの活性化機構と制御機構として普遍性を有すると考えられる。(3)レセプターシグナルの脱感作のメカニズムとその抑制機構と明らかにした。
3)G蛋白質シグナルの解析・制御ツールをデザインしシグナルを制御する:
G蛋白質活性化モデルに基づき、レセプター、βγを標的としこれを抑制するGα変異体を作製してきた。これまでの解析を応用して、各Gαの変異体のデザインを改良・作製した。
4)疾患モデル系への選択的遺伝子導入の試み:
遺伝子導入による制御・治療を展望して、G蛋白質変異体を、心肥大・高血圧などのモデル系の細胞/動物へ、アデノウイルスを用いて遺伝子導入し、効果を検討した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】38,610千円 (直接経費: 29,700千円、間接経費: 8,910千円)

【研究分野】食品科学・製品科学

【研究領域課題番号】07456058 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Taste / Signal transduction / G protein / Receptor

【研究成果の概要】

本研究は、申請者自身が世界で初めて成功した味覚レセプターのクローニング[J.Biol Chem.,.268,12033-12039(1993)]を基盤に、共役するGTP結合タンパク質、エフェクター、第二メッセンジャー、イオンチャンネルの解析を通じ、外来情報の最初のしかも主要な受容部位である味細胞におけるシグナル変換からシナプス電流発生までの細胞内シグナル伝達のプロセスの分子レベルでの解明を目的として実施された。
味覚の(主として甘味と苦味)の第二メッセンジャーとしてcAMPとIP3を生成することがすでに知られているが、この際に関与するGタンパク質はGsα、GqαおよびGiBγ分子種であると考えられている。申請者が味細胞に存在するGタンパク質を検索したところ、Gqαタイプの分子種G15-likeをラット舌ライブラリーよりクローン化することができた。このタンパク質の発現は味細胞にも観察されたことから、味覚のシグナル伝達、特にIP3の生成に関与しているものと推定している。またrサブユニットについてもその存在を検討してみたところ、舌に特異的ではないものの、新種の分子種のクローンを得ることができた。
得られたクローンを培養細胞(バキュロウィルスを用いたSf9細胞)を用いて発現させ、リガンド(各種味物質)による第二メッセンジャー(cAMPあるいはIP3)の濃度変化の測定を行ったところ、舌由来のクローンを発現させたものにおいて、とくにIP3の濃度について有為な差が観察された。各種味物質のうちでは苦味に対しての反応性が大きく、得られたクローンが苦味のシグナル伝達に関与している可能性が示唆された。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1995

【配分額】6,700千円 (直接経費: 6,700千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】06558107 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / 高次構造 / 大量発現 / 神経伝達物質 / TRNOE / Gタンパク質 / アセチルコリン / ムスカリン / レセプター / 伝達物質

【研究成果の概要】

本試験研究では、ムスカリン性アセチルコリン受容体を対象として高次構造解明の為の基礎研究を行った。当初の目的は下記の通りであった。(1)高次構造研究に必要な量の受容体を得るため、バキュロウイルスを用いた高度発現系及び抗原性の高いペプチドとの融合受容体を利用した効率的な精製系の開発、(2)十分量精製したムスカリン受容体の2次元結晶の調製と電子顕微鏡写真の解析による立体構造の解明、(3)リガント・受容体複合体のTransferred Nuclear Overhauser Effect(TRNOE)の測定、それによる受容体に結合したアセチルコリンの構造の決定とリガンド結合に関与するアミノ酸残基の構造の推定、(4)受容体3次元結晶の調製とX線による構造解析の検討。
3年間の研究で下記のような結果を得た。(1)バキュロウイルスを用いた高度発現系の開発、適当な変異体を用いた高効率精製系の開発を行うことが出来た。(2)精製した受容体の電子顕微鏡での観察で1次元的な配列を示唆する結果が得られたが、まだ2次元結晶は得られていない。(3)受容体に結合したメタコリン(S(+)-O-acetyl-β-metylcholine)のTRNOEの測定を行い、C-C結合がトランスの配置をとることを示す結果を得た。(4)3次元結晶作製には精製受容体量が不足しており、まだその試みを開始していない。
この研究の過程でいくつかの副次的な成果が得られた。(1)ムスカリン受容体m1-m5サブタイプをバキュロウイルス-Sf9系で発現させ、それらのリガンド特異性及び被可溶化能を決定した。(2)ムスカリン受容体m2サブタイプに特異的なアロステリックリガンド、αラパチョンを見出した。(3)ムスカリン受容体のカルボキシ末端にあるパルミチル残基の動態、機能を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1994 - 1996

【配分額】17,700千円 (直接経費: 17,700千円)