Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

構造生物学 / NMR / 膜蛋白質 / 転移交差飽和法 / 過渡的複合体 / ニ成分制御系 / マルチドメイン蛋白質 / 過渡的相互作用 / 膜タンパク質 / タンパク質―タンパク質相互作用 / 交差飽和法 / Protein Trans-Splicing / Segmental labeling

本研究では、申請者らの開発したNMR手法である交差飽和法を用いて、原核生物の走化性を制御する細胞内シグナル伝達タンパク質であるCheAとCheYの複合体が、反応部位同士が互いに近接した状態と、離れた状態の平衡状態にあることを明らかにした。これにより、CheAが、シグナル伝達に必要な二つの反応を、一つの反応部位で、両方とも効率よく進めているメカニズムが解明された。

構造生物学 / 生化学 / 膜タンパク質 / 核磁気共鳴法 / 光合成名反応 / タンパク質-タンパク質相互作用 / 電子移動反応 / 転移交差飽和法 / 光合成明反応 / Membrane protein / NMR / photosynthesis / protein-protein interaction / electron transfer / transferred cross saturation

プラストシアニン(Pc)は、膜蛋白質複合体である光化学系I(PSI)に素早く電子を輸送することにより、光合成明反応を効率良く進めている。本研究では、酸化型アナログであるカドミウム置換体(Cd-Pc)の調製法を確立して、当研究室で確立した転移交差飽和法(TCS)を用いて、Cd-PcのPSI結合部位を同定した。その結果、Pc上の銅原子の酸化に伴って、Loop1のコンフォメーションが変化することにより、Loop1を介したPSIとの相互作用が減弱し、電子移動後のPSIからの素早い解離が実現され、効率的電子輸送反応が起こることが明らかとなった。

NMR / 膜蛋白質 / 構造生物学 / 転移交差飽和法 / 光合成明反応 / 光化学系I / フェレドキシン / 循環的電子伝達

安定同位体標識を施したフェレドキシン(Fd)を、大腸菌BL21(DE3)-CodonPlus-RPを用いて大量発現させ、Sepharose 6B、 Resource PHE、 Hiload Superdex 75カラムを用いて、SDS-PAGEにて単一バンドとなるまで精製した。Fdの[2Fe-2S]クラスターは不対電子を持つため、その近傍のNMRシグナルは観測されない。そこで、その影響を見積もるため、Fdの主鎖に由来するNMRシグナルの連鎖帰属を行った。その結果、[2Fe-2S]クラスターの5Å以内に存在するY37-A48およびT76-A79のアミノ酸に対応するシグナルは観測されなかった。次に、Fd上の光化学系Iとの特異的相互作用残基を同定するために、Fdと可溶化した光化学系Iを混合し、TCS実験を行った。さらに、FQRとの相互作用を検出するために、光化学系IおよびFQRのFd結合界面が外側を向いた、right side-outベシクルを用いたTCS実験も行った。両TCS実験の結果を比較すると、K52近傍、D66近傍、V82近傍およびE30-I33は両方のTCS実験においてシグナル強度減少が観測されているのに対し、K4およびD84はベシクルとのTCS実験のみでシグナル強度減少が観測された。このことから、K52近傍、V82近傍、D66近傍およびE30-I33は、PSIとの結合界面上に存在し、K4およびD84はFQRとの結合界面に存在すると結論した。近年、低分子量チラコイド膜タンパク質PGR5がFQRの活性に必須であることが示された。しかし、PGR5がFdと直接相互作用しているか否かは明らかではない。PGR5変異株から調製したチラコイド膜ベシクルを用いたTCS実験における、K4およびD84の強度減少を調べることにより、この点を明らかにしたいと考えている。