【研究分野】放射線・化学物質影響科学

【研究領域課題番号】15F15382 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

メダカ / 放射線 / ホルモン / 紫外線 / 細胞死 / DNA損傷 / 電離放射線 / ナマズ / 赤血球 / コメットアッセイ / ノニルフェノール / 放射線影響 / 環境 / 血球

【研究成果の概要】

メダカは、飼育の容易さと飼育環境の温度域も広く、海水耐性も強いことから環境毒性試験に広く用いられている。本研究では、放射線、紫外線、内分泌撹乱物質、重金属による刺激後のメダカから血液を採取して血球におけるDNAダメージと血清内での分子変化の解析から生物影響を解明し、突然変異体と野生型を比較することで関連する遺伝子機能を明らかにすることを目指した。
本年度は、成魚の紫外線UVA照射による急性生物影響を赤血球におけるDNA損傷をγ-H2AX とコメットアッセイにより検出した。また、内部組織においても卵巣中の卵形成に急性障害が見られ、眼の網膜、脳、脊髄にも細胞死などの影響もでること、p53変異体では、電離放射線と同様に影響の程度が小さいことを確認した。今後、作製したサンプルからUVA照射した成魚の肝臓、腎臓、脾臓などの組織変化を調べるとともに、特に魚類の腎臓、脾臓、肝臓などに存在する褐色の色素を持ったマクロファージの集塊であるメラノマクロファージセンター（異物や老化した細胞を非特異的に貪食、消化して他の細胞に受け渡す機能を有すると考えられている）のUVA照射後の形成についても検討している。
また、4-Nonylphenol (4-NP)にばく露したメダカ成魚赤血球の形態異常、小核形成とアクリジンオレンジ染色による細胞死の検出を行い、濃度依存的にそれらが増加することを定量化した。先行研究で行なったナマズへの影響と比較したところ、メダカはより4-Nonylphenol (4-NP)に対する感受性が高く、環境中の毒性化合物の検出系として適していることが示された。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2015-11-09 - 2018-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】放射線・化学物質影響科学

【研究領域課題番号】21241016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射線 / 突然変異 / メダカ / マウス / 細胞死

【研究成果の概要】

放射線によるDNA損傷に対しては、DNA修復機構と細胞周期チェックポイント制御機構、損傷をもつ細胞を安全に排除するためのアポトーシス機構が協調して働いている。これに関わる遺伝子機能の多く同定されているが、個体レベルでの突然変異生成の組織特異性や、栄養条件や環境条件により放射線誘発突然変異生成にどのような差が生じるかについては今後の課題である。本年度は、個体内の生細胞を最終的対象するための解析モデルを作製することを目的として、以下の成果をえた。
1)TetO-GFP/tetRシステム細胞モデルの作製
tetracyclin operatorをプロモーター内に持つCMV-tetO-GFPユニットとTet repressorを導入したマウスとメダカ培養細胞(random integration)を作製した。フローサイトメーターを用いた実験から細胞の自然突然変異率と放射線誘発性の突然変異について計算する手法を開発した。
2)ストレス応答を可視化するメダカ系統の作製
ストレス誘導のかかるp21遺伝子のゲノム配列を解析し、発現制御領域を同定した。このプロモーターで制御されるGFP遺伝子を導入した培養細胞株を樹立し、放射線での発現誘導を確認した。
3)遺伝子維持機構不全突然変異体メダカ系統の作製
8-oxoGを除去するDNAグリコシラーゼ遺伝子であるOGG1遺伝子をノックアウトしたメダカを作製した。
これらの成果は、本年度採択された基盤S研究で有効に活用される予定である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2009

【配分額】20,410千円 (直接経費: 15,700千円、間接経費: 4,710千円)

【研究分野】放射線・化学物質影響科学

【研究領域課題番号】21221003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射線 / 突然変異 / メダカ / マウス / 細胞死 / 生殖細胞 / 咽頭歯 / DNA修復

【研究成果の概要】

放射線の生物影響を真に理解するには、分子から細胞レベルの知見から生体内のネットワークとしての組織応答を知ることが必要である。本研究では、新規改変遺伝子導入技術を利用して、放射線影響の可視化定量評価の系をマウス及びメダカで開発した。さらにメダカで細胞増殖能の高い組織の放射線照射後の応答を評価し、マウスとは異なる新規の応答を見いだした。マウスでも胎児期の腸では、成体と異なり、放射線照射後もアポトーシスが誘発されないで、増殖制御が進行するという報告があり、メダカ成体との共通性が示唆される。これによりゲノム損傷ストレスに対する脊椎動物に普遍的な応答解明の基盤が構築された。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2009-04-01 - 2015-03-31

【配分額】99,190千円 (直接経費: 76,300千円、間接経費: 22,890千円)

【研究分野】放射線生物学

【研究領域課題番号】01480532 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射線高感受性 / 細胞死 / 小腸上皮 / クリプト / 幹細胞 / Radiation / Radiosensitivity / Hypersensitive cells

【研究成果の概要】

マウス小腸上皮細胞群の分画方法を確立させた。すなわち、マウス体内より切り出し、さらに内外を反転した小腸組織から出発し、じゅう毛の先端部分から増殖単位であるクリプトの底部に至るまで、順次、細胞群を取り外しながら分画していく方法である。Iー125でラベルされたデオキシウリジンをマウス腹腔に投与し、上記操作にて小腸上皮細胞群の分画を行い、取り込まれた放射能をガンマカウンタ-にて測定した。さらに、酸不溶分画でもってDNA中に取り込まれている放射能を測定した。Iー125の放射能値のピ-クが1.5〜2.0時間の時点に出現するように操作を改良し、分画方法を確立した。マウス下半身に10Gyを照射し、照射後0.5〜5日にかけてのHー3チミジン反復投与法によりマウス腸上皮の幹細胞がラベルできることを確認した。さらにこのようにラベルしたマウスを長期間飼育し、0.5,1,2,3,4カ月の各時点でCー14チミジンを1回投与し、30分後に腸上皮の細胞群の分画操作を行い、液体シンチレ-ションカウンタ-にて、それぞれの放射能を測定した。幹細胞の分画(Hー3)はDNA合成細胞の分画(Cー14)と同一ではなく、しかもクリプト底部に対応した分画であることが示された。
同様にして幹細胞をラベルしたマウスを作成し長期間飼育した後、ガンマ線照射で細胞死を起こす細胞つまり放射線高感受性細胞とHー3チミジンを何ヵ月も保持する細胞(幹細胞)との同一性を調ベた。長期間ラベルを保持している細胞は休止期にあると考えられるが、このような細胞のクリプト内分布はクリプトの底部からの細胞位置で3番目近くにその中央値を示した。これに対し、0.5Gyまたは9.0Gyのガンマ線照射によって細胞死を起こした細胞のクリプト内分布は5番目付近に中央値を示した。つまり、長期間ラベルを保持する細胞と放射線高感受性細胞とは別の細胞集団であることが示された。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1989 - 1991

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)