Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

シナプス / グルタミン酸 / イメージング / 蛍光イメージング / グルタミン酸イメージング

神経回路での神経伝達物質の放出機構を理解には個々のシナプスでのグルタミン酸の放出ダイナミクスの精密な計測が必要である。本研究では脳標本における神経細胞のシナプスから放出された神経伝達物質グルタミン酸の高精細な蛍光イメージング技術の確立を目的とする。本研究では高性能グルタミン酸蛍光プローブの開発と神経細胞に選択的にグルタミン酸プローブを標識する技術の開発を行った。開発したグルタミン酸プローブをボツリヌス毒素の非毒性領域やHaloTag技術を採用することで神経細胞に選択的に標識することで、大脳皮質標本において放出されたグルタミン酸をシナプスレベルの解像度で可視化解析することに成功した。

ＡＴＰ / グルタミン酸 / イメージング / アストロサイト / 神経科学 / 薬理学 / ATP

我々のATPイメージングが海馬などのスライスでも可能であるかどうか検討した結果、海馬スライスのみならず、大脳皮質でもATP放出を観察することができた。この放出は領域特異的であり、アストロサイトがATPを放出し神経回路を制御していることを示唆した。また、チャンネルや開口放出の阻害剤を用いた薬理学実験の結果、どの薬剤を用いても放出イベント数は減少しなかったことから、この放出は薬理学的に多様なものであること分かった。そこで複数の阻害剤を混合して添加したときのATP放出の変化を調べた結果、このATP放出は、開口放出でなくチャンネルからの放出が主要な放出機構であることが分かった。

グルタミン酸 / イメージング / シナプス

計画の1年目として、神経伝達物質であるグルタミン酸を可視化するための蛍光性のグルタミン酸可視化プローブ(EOS)の改良を行った。EOSはAMPA型グルタミン酸受容体のGluR2サブユニットのグルタミン酸結合ドメインを基本骨格として利用して、その403番目アミノ酸残基のセリンをシステインに置換し、そのシステインのチオール基に選択的に蛍光色素オレゴングリーンを結合させたものである。EOSを用いて、標本中のどこのシナプスがどの程度のグルタミン酸を放出しているのかを高精細に解析することを可能にし、ホルボールエステル等の薬物処理を行うことで生じるシナプスの可塑的変化を単一シナプスレベルの分解能で経時的に捉える事ができた。以上のグルタミン酸可視化プローブの開発からそのシナプス伝達可視化への応用の成果をまとめ、論文として発表した(Namiki S, Sakamoto H, Iinuma S, Iino M, Hirose K. European Journal of Neuroscience,25,2249)。EOSを用いてより高精細なグルタミン酸イメージングを実現する為に、従来型EOSにアミノ酸変異を加えることで、従来型と比べ約50%のダイナミックレンジの向上が実現した。これにより従来型では困難であった単一シナプスレベルでのグルタミン酸放出を培養海馬神経細胞において、優れたS/N比で検出することに成功した。また、高次構造データや過去の報告を基にグルタミン酸結合に寄与していると予想されるEOS中のアミノ酸残基に変異を導入しグルタミン酸との親和性の調節を試みた。これによりnMオーダーからmMオーダーの解離定数を有する複数のグルタミン酸プローブのラインナップの整備ができた。

中枢神経細胞 / 神経生理学 / 超短パルスレーザー / ケイジド試薬 / グルタミン酸 / 受容体 / 生理学 / 2光子励起顕微鏡 / スパイン / 高性能レーザー / カルシウム / イメージング

これまでケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。そこで本研究において、可塑性に重要な役割を果たすNMDA受容体の機能と、スパイン形態との間の関係性を調べることを行った。実験方法としては、海馬錐体細胞にホールセルを行い、低親和性カルシウム指示薬と、細胞形態を同定するためのAlexa594をロードした。これはカルシウム指示薬によるカルシウム動態の影響を少なくするためである。細胞外液のマグネシウム濃度を減らした状態で、任意のスパイン部位に対して、2光子励起によってケイジドグルタミン酸を活性化した。その結果誘発される単一スパインにおけるNMDA受容体を介したカルシウム濃度上昇を、2光子励起顕微鏡を用いて、高速ラインスキャンを行ってイメージングした。Alxa594の蛍光に対するカルシウム指示薬の蛍光比によってカルシウム濃度変化を捉えた。この方法によって、一定刺激の条件でのスパイン内カルシウム濃度変化の絶対値を求めることができるようになった。カルシウム濃度上昇は、レーザー出力の2乗に比例し、あるところで飽和することから、スパイン頭部のNMDA受容体を2光子励起法によるグルタミン酸投与によって刺激できることを実証した。また1.5マイクロメートル以上離れたスパイン間では互いに刺激が干渉せず、個々のスパインだけの反応を得られることがわかった。NMDA受容体電流及びカルシウム濃度上昇は、AMPA受容体に比べ、ノイズが高いため、同一スパインにおいて3回刺激し、それを平均化することでCVの低い値を得ることができた。

【研究連携者】
廣瀬謙造	東京大学	大学院医学系研究科	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
古家喜四夫	名古屋大学	工学(系)研究科(研究院)	研究員	(Kakenデータベース)
並木繁行	東京大学	医学(系)研究科(研究院)	助教	(Kakenデータベース)

【研究連携者】
田中謙二	生理学研究所	分子生理研究系	助教	(Kakenデータベース)