Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

Cre / Pseudo loxP / loxP / トランスジェニックマウス / DNA顕微注入 / 遺伝子導入 / トランスジェニック / マウス / loxp / Cre酵素 / Pseudoloxp / psedoloxp / CAG

生殖系列に遺伝子を導入する際に利用されるDNA顕微注入法は、DNAの注入が前核でのDNA複製の開始が後に行われた場合、生産されたTg個体にはしばしばモザイクとなる。もし、外来遺伝子を保有する細胞が生殖細胞に分化していないと、外来遺伝子は子孫へ伝達されないためTg動物は一代限りのモザイクTg動物となる。DNA顕微注入法を利用してモザイクTg動物が作出されないように外来遺伝子を宿主ゲノムのpseduolox部位に組み込ませるためには、前核期胚でDNA複製前に注入したCre遺伝子の発現があり、この酵素の作用により外来pseudoloxp部位をもつ遺伝子と宿主ゲノム内のpsedoloxp部位との間で組み換えが起こることである。そこで、1)前核に注入したCre発現ベクターと両側にpseudoloxp部位をもつLaxZプラスミドを前核に注入したところ、DNAの複製前にCre酵素の発現とpseudoloxp部位での組み換えが生じたことが確認された。2)前核期に注入したCre酵素が発現し、宿主ゲノム内に存在するpseddoxp部位を認識して組み換えを起こすかを検証した。CMV/loxP/CAT/loxP/LacZ遺伝子が導入されたTgマウス(大阪大学医学部宮崎純一教授より供与)を通常のマウスと交配して採取した受精卵にDNA顕微注入法によりCAG/Cre発現ベクターを注入し、体外で桑実胚あるいは胚盤胞まで発生させた結果、DNA複製前で組み換えに組み換えが起ることが判明し、さらに、内在loxp部位で高い頻度で組み換えの起ることを見い出した。

HLA / ペプチド / 遺伝子導入 / 樹状細胞 / DC / マウス / 移植 / 免疫寛容 / 免疫制御 / トランスジェニックマウス / 異所性心移植モデル / HLAクラスI抗原

研究課題:HLA分子由来ペプチドと遺伝子導入樹状細胞を用いた寛容誘導の研究。
研究計画要旨及び実績概要:我々は以前、HLA抗原(HLA-B35及びHLA-B51)を移入したTransgenic mouse(TGM)2種類を作成し,HLAクラス1分子の免疫応答における役割を直接in vivo(異所性心移植モデル)で解析するシステムを開発した。このモデルにてドナー由来の合成ペプチドのレシピエント胸腺s内投与により移植心の生着延長を認めている(60日以上)。今回我々は、成人の退化した胸腺に変わり得るものとして、強力な抗原提示能を有する樹状細胞(DC)に着目し、遺伝子レベルで操作したDCと、上記アロ由来ペプチドとの接触により、胸腺内投与と同様の末梢性免疫寛容を上記TGM移植モデルにて誘導するのを目的としている。HLA抗原を移入したTGM2系統(C3H. B35及びC3H. B51)の回復及び免疫応答の確認:凍結胚からの回復後、約半年間の交配過程を経てTGM2系統共にホモ接合性の繁殖可能な個体が得られた。当研究計画の要ともいえる2系統間の同種免疫応答をin vivo及びin vitroにて確認した。C3H. B35からC3H. B51への皮膚移植片は平均15日間で90%が拒絶され、異所性心移植片は平均24日間で拒絶された。これらは当研究計画の基礎となる安藤らの報告(Ando and Beck et al.,Transplantation 68,904-908,1999.)とほぼ合致する所見である。また、C3H. B35皮膚移植片にて感作されたC3H. B51脾細胞を応答細胞、ガンマ線照射処理C3H. B35脾細胞を刺激細胞とし、混合培養することにより、E:T比80:1で50%を超える%特異的細胞障害活性を持つ同種(この場合はC3H. B35に対する)特異的細胞障害性Tリンパ球を生成し得た。マウス樹状細胞(DC):骨髄由来細胞から付着細胞を除外しGM-CSFおよびIL4を作用させることにより、混合白血球反応にて確認しうる同種免疫応答を惹起するアロ樹上細胞を生成し得た。これらのDCを使用してTGMの心移植、皮膚移植を行い、寛容誘導が可能か否か検討する。

音響外傷 / 遺伝子導入 / GDNF / アデノウイルス / モルモット / Shaker-2マウス / 蝸牛 / CDNF / ヘルペスウイルス / マウス

音響性聴覚障害においてははじめに蝸牛有毛細胞が障害され、その後ラセン神経節細胞等、蝸牛神経の障害が発現するとされている。GDNFはこのような音響性聴覚障害に対して予防効果を有することが報告されている。一方、遺伝子導入は蝸牛内へGDNFなどを持続的に発現させる方法として注目されている。今回の実験でははじめに遺伝性難聴のモデルであるShaker-2マウスを用いて蝸牛内への遺伝子導入の可能性について検討した。その結果、遺伝性難聴モデルにおいても正常マウスと同様に感染し、遺伝子導入が行われることが確認された。蝸牛支持細胞への導入はP1、P3、P5で不変だったが、その一方、導入された有毛細胞の数は日齢とともに減少した。導入パターンにおいてホモ(変異)型、ヘテロ型、正常マウスの3者間に差異は認めなかった。発達過程において、アデノウイルスによって遺伝子導入された有毛細胞の数が減少していくことが確認された。マウスにおいて、P5でもなお蝸牛支持細胞に対する導入が認められることから、アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入は、有毛細胞の前駆細胞である支持細胞に標的を絞った再生医療などの治療戦略にも適応を拡大できる可能性があると考えられた。次に、このアデノウイルスベクターを用いてGDNFの導入を試みた。ウイルスベクターを用いてGDNFは注入側に強く発現を認めた。GDNFを注入することで、有毛細胞消失後に生ずる、ラセン神経節細胞に対する予防効果は注入側よりも非注入側に非常に強く見られた。また注入側では基底回転により強く効果を認めた。遺伝子導入の技術がラセン神経細胞数の減少を食い止めることが判明した。内耳に対する遺伝子治療には解決すべき問題点は非常に多いが、まず期待されるのは、現存するベクターよりもさらに感染、遺伝子導入効率の高い新しいウイルスベクターの開発が望まれる。同時にウイルスベクターの内耳毒性や臨床応用に向けた投与法の改善についても検討していく必要があるだろう。

【研究分担者】
内藤邦彦	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
田原秀晃	東京大学	医科学研究所	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
志津木健	慶應義塾大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
小川郁	慶應義塾大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)