Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

古細菌 / 高度好塩性古細菌 / キチナーゼ / Halobacterium sp. NRC-1 / Haloarcula japonica / 反応至適pH / 反応至適温度 / 反応至適塩濃度 / Halobacterium sp.NRC-1 / PCR / 遺伝子クローニング / 遺伝子発見

既にゲノム解析により、高度好塩性古細菌Halobacterium sp. NRC-1株にはキチナーゼホモログをコードする遺伝子が存在することが報告されているが、タンパク質としての実態は明らかにされていない。本研究ではNRC-1株キチナーゼの酵素学的性質、耐塩機構の解明および工学応用を目指した研究を行った。以下1および2に実績の概要を示す。
1.Haloarcula japonicaにおけるキチナーゼ遺伝子の発現と組換え型キチナーゼの精製
高度好塩性古細菌用キチナーゼ遺伝子発現型プラスミドを構築し、発現型プラスミドを導入したH.japonica形質転換体より、培養上清を回収した。次に限外ろ過濃縮した後、ヒドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーを行い、組換え型キチナーゼの精製を実施した。その結果、分子質量約70kDaの位置に単一バンドを示す精製標品が得られた。
2.組換え型キチナーゼの性質検討
組換え型キチナーゼ精製標品用いて、37℃における反応pH依存性およびpH6.0における反応温度依存性を調べた。その結果、本酵素はpH4.5付近に反応の至適を有し、至適温度は55℃であることがわかった。またpH6.0、37℃において、キチナーゼ活性のNaCl濃度依存性を調べたところ、組換え型キチナーゼは1M付近に反応の至適を有することが明らかとなった。.また、NaClが0M付近の活性は最大活性40%程度であり、活性発現に塩を必要とすることがわかった。

フェレドキシン / 高度好塩性古細菌 / 精製 / 鉄-硫黄クラスター / PCR / 遺伝子クローニング / 融合発現

Haloarcula japonicaは三角形平板状の形態を有する高度好塩性古細菌である.本研究では,H.japonicaに由来するフェレドキシン(Fd)の構造と機能ならびに耐塩性に関する知見を得ることを目的として,H.japonica Fdの精製と性質検討,さらには遺伝子クローニングと大腸菌での発現を行った.
菌体抽出物から,脱塩・陰イオン交換クロマトグラフィー・ゲルろ過の操作により,H.japonica Fdを精製した.H.japonica FdのN末端30アミノ酸の配列を決定した.また,電子スペクトルおよびESRスペクトル解析より,H.japonica Fdは2鉄型クラスターを持つことがわかった.
H.japonica FdのN末端アミノ酸配列ならびに類縁菌Fdのアミノ酸配列相同性に基づくプライマーを用い,H.japonica染色体DNAを鋳型とするPCRを行い,H.japonica Fd遺伝子の一部を増幅した.そして,このPCR産物をプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより,H.japonica部分染色体ライブラリーの中からFd遺伝子をクローニングした。H.japonica Fd 遺伝子は387ntのオープンリーディングフレームからなり,129アミノ酸をコードしていた.また,H.japonica Fdは類縁菌Fdとアミノ酸レベルで87%〜98%の高い相同性を有していたものの,植物型Fdの代表であるほうれん草Fdとは43%の相同性しか示さなかった.H.japonica Fdは,他の高度好塩性古細菌Fdと同様,N末端ならびにC末端がほうれん草Fdより長く伸びており,この領域が耐塩性に関与している可能性が示唆された.
次に,大腸菌におけるH.japonica Fd遺伝子の発現を試み,N末端にT7tagもしくはグルタチオンS-トランスフェラーゼを結合させた形での融合発現に成功した.これら2種の融合タンパク質の精製を行ったところ,いずれにおいてもクラスターが組み込まれていないことがわかった.

高度好塩性古細菌 / 細胞表層糖タンパク質 / 遺伝子クローニング / 遺伝子発現 / PCR

Haloarcula japonica TR-1株は、石川県塩田土壌より分離された三角形平板状の形態を有する高度好塩性古菌一種である。本研究では、その形態維持機構の解明を目的として、H.japonica細胞表層の解析を行った。H.japonicaの細胞表層画分を電気泳動にかけたところ、本菌の細胞表層には分子量約17万の糖タンパク質(Cell Surface Glycoprotein:CSG)が多量に存在することがわかった。また、三角形平板状に生育させた菌を含む培地からマグネシウムイオンを除去したところ、菌は球状に変化した。菌の形態変化に伴い、CSGの菌体からの遊離が認められた。以上より、CSGは本菌の形態維持に密接に関与していることが強く示唆された。H.japonicaの細胞表層よりCSGの精製を行い、糖含量およびアミノ酸組成を明らかにした。次に、類縁菌由来のCSG遺伝子との相同性を想定することにより、本菌CSG遺伝子のPCRによる増幅を試みた。既報の類縁菌CSG遺伝子の相同領域に対応する合成DNAをプライマーとして用い、H.japonica染色体DNAを鋳型とするPCRを行った。その結果、約900塩基対のDNA断片が増幅され、本菌CSG遺伝子の一部と考えられた。そこで、H.japonica染色体ライブラリーを作製し、PCR産物をプローブとするコロニーハイブリダイゼーションおよび遺伝子ウォーキングを行い、CSG遺伝子全域を含むDNA断片のクローニングすることができた。さらに、本菌CSG遺伝子の大腸菌における発現にも成功した。

【研究分担者】
中島春紫	東京工業大学	生命理工学部	助手	(Kakenデータベース)
青野力三	東京工業大学	生命理工学部	助教授	(Kakenデータベース)
堀越弘毅 (掘越弘毅	堀越弘穀)	東洋大学	工学部	教授	(Kakenデータベース)