Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

マイクロマシン / 微小細管 / 3次元微細加工 / グレイスケールリソグラフィ / SU-8 / PDMS / 血球細胞 / 血小板 / マイクロマシニング / マイクロチャネル / 赤血球 / 白血球 / ポリジメチルシロキサン / 感光性ガラス / 水ガラス接合 / フォトレジスト

PDMSの型となるネガ型フォトレジスト(SU-8)に対するグレイスケールリソグラフィを行い、形成したレジストの3次元構造体をPDMSに転写して、感光性ガラスより透明なPDMSの3次元流路構造体、すなわちPDMSを基板とするμ-Fluidic Deviceの作製を行った。これにチャネル構造の覆いとなるPDMS対向基板にサンプル流出入孔を設け、両者を圧着して3次元微小細管を作製、またマイクロポンプを装着し、流量可変のサンプル液量制御を行った。別途Au・Kr電極を真空蒸着した薄板状ガラス基板をサンドイッチ構造に圧着して電界効果を利用したサンプル制御を行った。これは複素誘電率ε_p^*の微小サンプルが複素誘電率ε_m^*の媒質内に浮遊しているとき、この媒質の両側に不平等電界E_<rms>を印加すると、誘電泳動力F_dが電界の二乗の勾配に比例する力としてサンプルに作用するという誘電泳動現象を利用したものである。この誘電泳動力によりデバイス内のサンプルを旋回・攪拌することが可能となる。サンプルの検出系には高速ビデオ画像処理方式を使用し、血球細胞とくに血小板の凝集状態を蛍光可視化解析することに成功した。本研究では、数値シミュレーションにより誘電泳動力に対する電界強度、印加周波数、電極配置、サンプル誘電率、サンプル粒子径などの諸パラメータの依存性を検討した。上記で得たμ-Fluidic Deviceに対して、以下の検討を行った。(1)流路の流体力学的特性評価、(2)サンプルの旋回流れの観測、(3)機械的手段を用いないサンプルの攪拌・混合・沈殿防止・壁面付着防止の実現、(4)血球細胞とくに血小板の流動・粘着能の評価、などであるが、実測結果は数値シミュレーションともよく一致し、赤血球の変形流動能の観測や血小板凝集能亢進過程の観測に有効であることが示された。

微小循環 / マイクロマシーン / 赤血球 / 血小板 / 糖尿病 / 粘弾性 / 変形能 / 原子間力顕微鏡 / 血栓

マイクロマシーニング技術を利用して透明な石英ガラスに毛細血管、細動静脈レベルのマイクロチャネル小血管モデルを形成し、加圧負荷により流路内に定常流を与えるin-vitro実験システムを構築した。流動赤血球の変形状態を顕微鏡下で高速度ビデオ録画し、撮像画像の画像処理により流速と変形能(パラシュート状に変形した赤血球の長軸方向と短軸方向の長さ比)を求めた。また、原子間力力顕微鏡(AFM)により赤血球単体のフォースカーブを測定し、Hooke及びHertzモデルを適用して赤血球のバネ定数とヤング率を求めた。マイクロチャネル内を流動する赤血球の変形能は流速(壁ずり速度)に依存するが、低流速域で変形能上昇、中流速域で漸増傾向を示し、高流速域では変形飽和傾向すなわち変形限界に達する。健常例に比べて糖尿病赤血球では変形能が低く、中流速域で既に変形限界に達する。高脂血症の赤血球でも同様な特性を示した。ラット腸間膜微小循環を対象にしたin-vivo観測でも糖尿病赤血球の変形能は健常群に比べて有意に低下し、変形能と血糖値及びHbA1cとの間に負の相関を示し、高血糖状態の変形能は有意に低下する。また、高脂血症ではコレステロール値と変形能の間に負の相関が得られ、コレステロール化促進に伴い変形しにくくなることが認められた。AFMによる赤血球単体のバネ定数とヤング率は、グルタールアルデヒド硬化赤血球及び糖尿病赤血球ともに健常例より有意に高値を示し、赤血球膜の硬化あるいは赤血球実質の弾性低下が示された。一方、微小循環における血小板凝集粘着、血栓形成の発生機序と血栓抑制の薬理効果を解明するために、光感受性物質とレーザ光化学反応で産生される活性酸素による血栓形成法を導入し、対象部位の血流動態をビデオカメラで撮像後、血小板粘着・血栓形成による血管閉塞部の面積、血管径の経時変化、閉塞時間などを画像解析から求めた。これより血管内皮傷害と血小板粘着能の活性化を反映する指標、血小板粘着凝集能及び凝固系の活性化を反映する指標、血栓進行・血管完全閉塞を表す指標を評価し、ラット腸間膜in-vivo実験において糖尿病群で血栓形成が早期に起こることを明かにしている。また、スカベンジャーを用いて活性酸素種の血小板粘着・凝集及び血管閉塞への関与を討した結果、活性酸素種によって血小板の粘着凝集が異なる様相を呈することを明らかにした。

血液適合性 / In vitro試験 / 評価回路 / 血栓 / 血小板 / フィブリン網 / ACT / 人工弁 / 溶血実験 / 表面粗さ / 新鮮血 / 血液凝固 / 赤血球 / 循環回路

第3年度は,人工弁・人工心臓などの開発の早期に血液適合性をある程度評価でき,また,設計改良の指針となるデータを得ることが可能な,より信頼性のあるin vitro血液適合性評価試験回路の開発を目指した.
第一に,回路内での血液と空気の接触面を完全に排除した4つの同一形状の旋回渦流型血液ポンプで構成される一巡閉鎖回路を開発した.4つの血液ポンプのうち1つのみを駆動し,他の1つはコンプライアンス,残りの2つはリザーバの役割を持たせることで,平均大動脈圧100mmHg,平均ポンプ拍出量2.5L/minといった実際の使用環境に近い試験環境にすることができた.また,washout性能の極めて良好な旋回渦流型血液ポンプを回路の構成要素として用いることで,流れの停滞領域のない試験回路を開発することができた.第二に,チューブやコネクタなど試験回路の構成パーツに対する血小板の活性能を同一にするために,血液ポンプと同一材料で回路内面全体をコーティングした.なお,本研究では新開発の高分子製二葉弁を血液適合性評価試験対象とした.
開発した回路内をヘパリン化した新鮮牛血液で満たし,その後プロタミンで中和してACTを300sec〜400secに調節した後に試験を開始した.採取した血液中の血小板の活性能時間を考慮して,試験は4時間で終了した.試験後の弁葉表面をSEMによって観察した結果,(1)弁流出側の弁葉表面では血球成分の付着及びフィブリン網などが全く観察されず血液適合性は良好であったが,流入側の弁葉表面では弁閉鎖時にスポークと接触する部分の吸着タンパク質層に磨耗跡が観察された.また,(2)弁座と弁葉の接着部分に血小板の付着が観察された.以上から,新たに開発したin vitro血液適合性評価試験回路は製品開発の早期に問題点を明確にするのに極めて有効であることが明らかとなった.

酸素化ステロール / GC-MS / 微量分析 / 血液成分 / 血小板 / プラスミノーゲン活性化因子 / 植物ステロール / 赤血球 / 血液

本研究は酸素化コレステロール誘導体を含む各種コレステロール類縁化合物の血漿中、血管内壁、赤血球、血小板などにおける生理・病理的意義を明らかにしようとするものであり、以下に示す研究成果を得た。
1.血管内皮細胞(ウシ頸動脈より得た)で合成され血液中に放出されるプラスミノーゲン活性化因子(この酵素の欠損は血栓形成を促す)について、この産生を促進する物質を探索し、シトステロールおよびフコステロールが著しい作用を示す事を見いだした。
2.酸素化ステロール類の血小板の凝集への影響を調べた。即ち、ウシ血小板浮遊血漿を用いる実験で、トロンビン凝集では、20-,22-,24-,または25-ヒドロキシコレステロールが凝集を促進するのに対し、ADP凝集で(22R)-ヒドロキシコレステロールに特異的な凝集促進作用があった。(22R)-ヒドロキシコレステロールが特異的にウシ血小板および赤血球に対して、膜の破壊を引き起こすことを見いだした。また、この溶血作用には温度依存性が有ることが分かった。
3.細胞膜中でのコレステロールとリン脂質の相互作用の解明に向けて、各種光親和性標識ステロイドを合成し、モデル系での光反応を検討した。
4.中国産Bombyx cum Botryte(彊蚕)の酸素化ステロールを分析した。5.コレステロール生合成を制御する目的で、合成した各種ヒドロキシステロールのラット肝でのジヒドロラノステロールからコレステロールへの生合成の阻害作用を調べ、顕著な作用を示すステロールを見いだした。
6.アンジオテンシン変換酵素抑制作用のある新規トリテルペン5種を霊芝Ganoderma lucidumから単離・構造決定した。
7.高血圧・動脈硬化患者の血清中のステロールの分析を行った。

【研究分担者】
松本佳宣	慶應義塾大学	理工学部	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
関塚永一	国立埼玉病院	内科	臨床研究部長
田中敏幸	慶應義塾大学	理工学部	講師	(Kakenデータベース)
谷下一夫	慶應義塾大学	理工学部	教授	(Kakenデータベース)
大塩力	亮友会大塩医院	院長

【研究分担者】
川田宏之	早稲田大学	理工学部	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
斎藤佑尚	東京工業大学	理学部	助手	(Kakenデータベース)
稲田祐二	東京工業大学	理学部	教授	(Kakenデータベース)
藤本善徳	東京工業大学	理学部	助手	(Kakenデータベース)
森崎益雄	東京工業大学	理学部	助教授	(Kakenデータベース)