【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】19390017 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

薬物トランスポーター / 上皮細胞 / 線虫 / 細胞内輸送 / スクリーニング / RNAi / 細胞極性 / メンブラントラフィック

【研究成果の概要】

薬物トランスポーターPGP-1のアピカル膜への局在制御に関与する因子群を明らかにする目的で、PGP-1-GFPを発現するトランスジェニック線虫を作成し、それを用いてRNAi及び突然変異誘発法による遺伝学的スクリーニングを行った。その結果、微小管に沿って小胞を輸送するモータータンパク質であるダイニン/ダイナクチン複合体の構成因子や膜融合に関与するSNAP29などがPGP-1のアピカル膜への局在制御に関与していることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】08760069 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

開口放出 / 神経伝達物質 / 調節性分泌 / 生理活性物質 / シナプス小胞 / 細胞内輸送 / 膜融合 / スクリーニング

【研究成果の概要】

神経伝達物質の開口放出を特異的に阻害する生理活性物質を得るため、PC12細胞からの脱分極刺激に応じたノルエピネフリン(NE)放出阻害を指標としてカビおよび放線菌の培養抽出液の検索を行った。再現性よく阻害活性が認められたカビからの2サンプル(LF11039、LF10512)、および放線菌からの2サンプル(LS9940、LS8877)について、好中球からのβ-グルクロニダーゼ放出に対する作用を調べた。その結果LF11039、LF10512、LS9940はいずれも強い阻害活性を示したが、LS8877は殆ど阻害しなかった。このことから前三者は膜融合過程など調節性分泌に共通する過程の阻害剤であること、またLS8877は神経分泌に特異的な阻害剤であることが示唆された。
次に最も活性の強いLF11039物質の精製を試みた。生産菌を大量培養し、菌体から80%アセトン抽出、酢酸エチル転溶を行った後、ヘキサン-メタノール系およびクロロホルム-メタノール系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、約19mgの淡黄色の結晶を得た。本物質は230、252、320、370nmの各波長に吸収極大を示し、またFAB-MSスペクトルでは、(M+Na)^+:m/z=413、(M+K)^+:m/z=429にイオンが観測され、本物質の分子量が390であることが推定された。^1H-NMRスペクトルには9個のプロトンシグナルが認められ、全て芳香環に結合したプロトンと考えられた。^<13>C-NMRスペクトルからは15〜16本のsp^2の炭素のシグナルが観測され、本物質はすべての炭素原子がSP^2である芳香族多環性物質であると考えられた。しかし最終的な構造決定には至っていないことから、引き続き精製・機器分析を行い、活性物質の構造を明らかにする予定である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1996

【配分額】900千円 (直接経費: 900千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】07760076 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

開口放出 / 神経伝達物質 / 調節性分泌 / 生理活性物質 / シナプス小胞 / 細胞内輸送 / 膜融合 / スクリーニング

【研究成果の概要】

一次検索系としてPC12細胞からのノルエピネフリン(NE)放出阻害を指標とし、カビ2200株、放線菌3600株の培養抽出液の検索を行った。続いて二次検索系としてCa^<2+>イオノフォアであるイオノマイシン(1mM)存在下に同様の実験を行った。再現性よく阻害活性が認められたものについて、さらにATPの放出阻害についても検討した。その結果、カビからの2サンプル(LF11039、LF10512)、および放線菌からの2サンプル(LS8877、LS9940)に顕著な阻害活性を見出した。これについてさらに三次検索系として好中球からのβ-グルクロニダーゼ放出に対する作用を調べた。その結果LF11039、LF10512、LS9940はいずれも強い阻害活性を示したが、LS8877は阻害よりもむしろ若干促進するという結果を得た。このことから、前三者は調節性分泌に共通する過程(おそらく膜融合過程)の阻害剤であるが、LS8877は神経伝達物質の放出に特異的な阻害剤であることが示唆された。またアクリジンオレンジを用いて酸性オルガネラに対する作用を調べた結果、候補物質はいずれも阻害活性を示さず、分泌阻害剤であるコンカナマイシン類とは作用が異なることがわかった。さらに候補物質の毒性をPC12細胞を用いて調べたところ、いずれもNE放出を阻害する濃度で増殖の抑制はみられなかった。この結果は候補物質が調節性分泌に特異的な機構を標的としていることを示唆する。
次に各活性物質の精製を行った。比較的活性の強いLF11039株を大量培養し、菌体から80%アセトン抽出、酢酸エチル転溶後2回のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、約19mgの淡黄色の結晶を得た。本物質は230、252、320、370nmの各波長に吸収極大を示し、またFAB-MSスペクトル解析の結果分子量が390であることが解った。^1H-および^<13>C-NMR解析から15〜16個の炭素のシグナルが認められ、それらがいずれもSP^2炭素であることが示唆された。LF10512、LS8877、LS9940についても精製を試みている。以上いずれの物質も最終的な構造決定には至っていないことから、引き続き精製・機器分析を行い、活性物質の本体を明らかにしたい。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1995

【配分額】1,100千円 (直接経費: 1,100千円)