【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】20249060 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体イメージング / 光イメージング / 発光 / caspase-3 / アポトーシス / 分子機能 / 抗体診断・治療 / ライブ診断 / 発光イメージング / 光プローブ / ストレスイメージング / カスパーゼ / トランスジェニックマウス / 肝腫瘍 / 抗体診断 / Dlk-1

【研究成果の概要】

本研究では、以下のふたつのテーマに関して、研究を行なった。
テーマA:小動物モデルをもちいて種々の病変に対する質的診断、薬剤感受性の検討を目的とした生体イメージング法の開発: luciferase-baseの新規機能プローブ開発によるin vivo imaging。Luciferase をbase としてCaspase-3に対する活性化プローブを作製し、それをアデノウィルスベクターに導入した。このベクターをもちいて様々な細胞、マウス肝臓に遺伝子導入を行ない、細胞レベルおよびマウス実験を行なうことにより、caspase-3 活性(アポトーシス)の生体イメージングに成功した。特に、低酸素・再酸素化、虚血・再灌流時および肝臓切除後再生時に起こる酸化ストレスとアポトーシスの動的解析に成功した。
テーマB:腫瘍特異的抗体への発光・蛍光ドットデュアルプローブの搭載による新しい診断・治療法の確立(術中診断を含め): in vivo/ex vivo imaging。様々な癌細胞抗原(Dlk-1/CEA/EMA/Ep-CAM)に対する抗体を用意し、それらに対して我々が独自に開発した上記光プローブを搭載した。種々の癌細胞におけるこれらの抗原の発現をFACS/Western Blotにて確認した後、ヌードマウスへの移植実験を行ない、モデルを作製した。Dlk-1抗原を発現する肝細胞癌移植実験モデルをもちいて(マウス皮下および肝内)、開発したプローブの有用性を確認した。マウスにおける実験で、紫外線などの照射を必要とせず、基質投与のみで近赤外領域の長波長のシグナルを腫瘍から発することが確認され、また深部病変の検出にも有用である可能性が示唆された。現在他の抗原に対するイメージング実験を行なっている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】49,010千円 (直接経費: 37,700千円、間接経費: 11,310千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】17590706 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受動体チロシンキナーゼ / ドミナントネガティブ変異体 / トランスジェニックマウス / 心不全 / シグナル伝達系 / ミトコンドリア / アポトーシス / トランスクリプトーム / 受容体チロシンキナーゼ

【研究成果の概要】

Epidermal growth factor receptor (EGFR), ErbB2, ErbB3, ErbB4により構成されるErbBファミリーの受動態チロシンキナーゼは細胞増殖や分化、肥大など様々な細胞応答において重要な役割を果たしている。また、ErbBシグナルは多様で機能重複が存在する。
ErbBシグナルの心筋細胞における役割を生体レベルで解析するために、細胞内ドメインを欠失したEGFRドミナントネガティブ変異体をα-myosin heavy chainプロモーターによって心筋特異的に発現するトランスジェニックマウス(EGFR-DNマウス)を作成した。EGFR-DNマウスの心臓では、EGFやheparin-binding EGF-like growth factorによるEGFR, ErbB2, ErbB4のチロシンリン酸化、およびneuregulinによるErbB2, ErbB4のチロシンリン酸化が抑制されていた。その結果、ほとんどのTGは症候性の心不全をを呈し、5~20週齢で死亡した。TGでは心内腔の拡大と心室壁の菲薄化が見られ、心エコーでは心機能低下が認められた。また、EGFR-DNマウスの心臓ではTUNEL陽性の心筋細胞の有意な増加が見られるとともに、心不全発症前の2週齢の心臓から抽出したRNAサンプルを用いてGenechipを用いた遺伝子発現プロファイリングを行った結果、抗アポトーシス作用を有するBc12やBc1xLの発現低下が認められた。さらに、電子顕微鏡では、電子密度の減少した特徴的なミトコンドリア像が見られた。したがって、ErbBシグナルは心筋細胞においてミトコンドリアの構造機能の恒常性維持、さらにBc12やBc1xLの発現を転写レベルで維持することで、心筋保護的に作用している可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13470053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 発生 / EAT遺伝子 / ES細胞 / コンディショナル・ターゲッティング / bcl-2ファミリー / 遺伝子改変マウス / EAT / bcl / mcl-1 / mcl1 / トランスジェニック・マウス / ミトコンドリア / 細胞死

【研究成果の概要】

EAT/mcl1遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EAT/mcl1の発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、胚性幹細胞(ES細胞)においてEAT/mcl1を欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行った。
Cre-loxPシステムを用いてEAT/mcl1遺伝子をマウス個体、ES細胞においてコンディショナルにノックアウトするために、EAT/mcl1のexon 1をloxPで挟むような変異を導入するターゲッティング・ベクターを導入することによりES細胞(TT2細胞)の一方の対立遺伝子に変異を導入することに成功した。11個のES細胞のクローンが得られ、5個のES細胞をマウス初期胚(胚盤胞)へ注入することによりキメラマウスを得た。それらより3ラインのマウスのラインを確立した。これらのマウスをCre recombinaseを発現するトランスジェニック・マウスと交配することにより以下のマウスを得た。1)EAT/mcl1のexon 1が破壊されたマウス(EAT/mcl1遺伝子1個のみ破壊されたヘテロ接合性のノックアウトマウスであり、表現形は、現在のところ、形態学的には野生形と同様と考えられる。このことはEAT/mcl1の発現量が通常の1/2となってもマウスは、正常に発生.分化することを示唆している)。2)EAT/mcl1のexon 1の両端にloxP配列が挿入されたマウス(このマウスは、両アレルとも正常なEAT/mcl1を有するが、臓器特異的Creトランスジェニック・マウスの交配により、コンディショナル・ノックアウトを作成することが可能である)。また、MEOXマウス(胎生5日目以降に、胚盤葉上層(将来、胎仔となる領域)特異的にCre recombinaseを発現するマウス)の導入を終了した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2004

【配分額】14,100千円 (直接経費: 14,100千円)

【研究分野】食品科学・製品科学

【研究領域課題番号】09760122 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

食品アレルギー / T細胞 / 免疫応答 / 経口免疫寛容 / アポトーシス / トランスジェニックマウス / 免疫学 / 食品科学 / 細胞生物学

【研究成果の概要】

食品アレルギーの発症機構の解明,またその予防・治療法の開発には経口投与された抗原に対する免疫応答の正負の免疫応答制御機構の解明が重要である.このような応答にはT細胞が重要な役割を果たす.本研究では卵白アルブミン(OVA)特異的T細胞抗原レセプター(TCR)トランスジェニックマウス(Tg)を用いて経口投与抗原に対するT細胞応答を解析した.既に,OVA特異的TCR-TgにOVAを経口摂取させると,脾臓においてTh2型サイトカインを産生するが,B細胞の活性化に重要な役割を果たすCD40L分子の発現能が弱いT細胞が誘導されることを明らかにしている.そこでこのT細胞におけるTCRからのシグナル伝達について検討した.その結果,細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させるイオノマイシンの添加により経口抗原により誘導されたT細胞のCD40L分子の発現能が回復した.T細胞においては通常TCRからの刺激により,イノシトール代謝系が亢進する結果細胞内Ca^<2+>濃度が上昇し,様々な細胞応答を引き起こすことが知られているが,経口抗原により誘導されたT細胞においてはこのカルシウム経路に何らかの障害があり,CD40L分子の発現能が弱いことが示唆された.このようなT細胞は,抗体応答を介助する機能(ヘルパー機能)が弱いと推測されたが,予想に反し,OVA特異的TCR-TgにOVA飼料を長期間摂取させると,強い血中抗体応答が誘導された.現在,このマウスにおける抗体応答誘導機序について検討中である.一方,OVAを経口投与したTCR-Tgにおいてパイエル板,胸腺において経口抗原による抗原特異的T細胞・胸腺細胞のアポトーシス誘導が示された。これより末梢T細胞のみならず,胸腺細胞のクローン消去も経口免疫寛容誘導に関与することが示唆された.

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)