【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】23590120 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞死 / 神経薬理学 / アポトーシス / マイクロ流体システム / ミクロ薬理学 / 薬理学 / マイクロ流体デバイス

【研究成果の概要】

本研究は、単一培養細胞における細胞死の位置特異的情報について細胞内のマイクロドメインの寄与について検討するためにマイクロシステムの構築とその応用を目的とした。マイクロ流体デバイスによって、孤立化した複数の単一細胞を非侵襲的に捕獲およびその場所での微小培養を実現し、層流による局所的な薬液曝露による細胞死誘発刺激の負荷を行ったところ、細胞核付近でアポトーシスのエフェクターカスパーゼである活性型Caspase-3の発現を誘発するためには、細胞突起部のマイクロドメインに限局したストレス負荷で充分であることを確認した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011-04-28 - 2015-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】17659527 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / 薬剤反応性 / 内耳 / 蝸牛 / 難聴 / 有毛細胞 / アミノ配糖体 / 細胞死 / アポトーシス / 蛋白治療

【研究成果の概要】

細胞死を防御する蛋白質を投与して、内耳障害の予防・治療に応用する蛋白治療を開発した。ミトコンドリアからのチトクロームcの放出を抑えるBcl-XLの三つの水素結合を除去したanti-apoptotic蛋白(FNK)を作成し、これにHIV/Tat蛋白のProtein Transduction Domain(PTD)をくっつけて細胞内に導入できるようにした(FNK-PTD)。まずこの蛋白にmycをtagとして付けたものをモルモットの腹腔内投与し、1-6時間後に断頭し、蝸牛を固定し、パラフィン切片を作成した。その後Myc抗体を用いた免疫染色により蝸牛での発現について検討した。その結果、投与1時間後からこの蛋白は蝸牛内に出現し、3時間後に発現量がピークとなり、6時間後には著明に減少することがわかった。発現部位は、主にコルチ器、ラセン神経節であった。つぎにFNK-PTDが蝸牛有毛細胞の細胞死を予防できるかどうか検討した。カナマイシン((1)200mg/kg、または(2)400mg/kg)およびエタクリン酸((1)40mg/kgまたは(2)50mg/kg)によりモルモットの蝸牛有毛細胞を広範に障害し、この前後にFNK-PTDまたは生食を投与した。1週間後ABRを測定し、断頭後蝸牛を固定し、surface preparationにより残存有毛細胞の数をカウントした。その結果FNK-PTD投与群では(1)および(2)のどちらの障害においても有意にABR閾値の上昇を抑制し、内外有毛細胞ともに有意に細胞死を抑制した。また(2)の条件で障害8時間後にcPARP陽性細胞を調べるとFNK-PTDにより有意に減少していた。この結果はFNK-PTDが蝸牛に発現して、耳毒性薬剤による有毛細胞の細胞死を抑制することを示している。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】15100007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョバエ / 遺伝学 / 神経発生 / IAPファミリー / イメージング / キナーゼ / プロテアソーム / 神経細胞死 / ショウジョウバエ / 神経変性 / タンパク質分解 / アポトーシス / JNK / 蛋白質分解 / 神経細胞 / 細胞死 / 発生 / マウス / 細胞選択

【研究成果の概要】

ショウジョウバエ遺伝子の過剰発現スクリーニング(GSスクリーニング)を取り入れることで、神経細胞死シグナルの機能的的ゲノムスクリーニングを行った。ポリグルタミンによる神経細変性に関与する遺伝子として小胞体に存在する不良品蛋白質の輸送チャネル(Sec61α)を同定した。Sec61αは、分泌経路で合成される蛋白質の小胞体への移行と、小胞体関連タンパク質分解Endoplasmic Reticulum Associated Degradation : ERADにおいて小胞体から細胞質への不良品タンパク質の輸送を担う重要なチャネルである。Sec61αをショウジョウバエ複眼や培養細胞で過剰発現すると不良品タンパク質が細胞質に逆輸送されて蓄積し細胞死が誘導されること、逆にSec61αの活性を遺伝学的に弱めることによりポリグルタミン病モデルにおいて細胞質に蓄積していた不良品タンパク質が減少し、晩発性の神経変性が回復することが明らかになった。さらに、GSスクリーニングによって、神経細胞死シグナルを発する候補遺伝子としてDmIKKεが得られた。遺伝子の機能欠損スクリーニングによってもDmIKKεが得られ、細胞死を誘導しないレベルのカスパーゼ活性を調節することを見いだした。細胞死シグナルに関与する遺伝子のスクリーニングからDmIKKεが得られたことをふまえてその基質を探索した結果、種を超えて保存されたカスパーゼ抑制因子DIAP1が同定された。DmIKKεはDIAP1をリン酸化することによってその分解を促進する。DmIKKεを生体でノックダウンすると内在性のDIAP1レベルが組織で上昇した。しかし、この状態でも発生過程での細胞死は正常におこり、ここでのDmIKKεによるDIAP1レベルの調節は細胞死以外の生理機能に関与することが示唆された。本研究が明らかにした段階的なカスパーゼ活性化による神経選択の新たな仕組みは、発生と神経変性での細胞運命決定機構に新たな視点をもたらしたものである。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】119,080千円 (直接経費: 91,600千円、間接経費: 27,480千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】15390164 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

記憶B細胞 / 辺縁帯B細胞 / ケモカイン受容体 / デコイ受容体 / 3940 / 細胞死 / Alternative Splicing / スフィンゴシン-1-リン酸 / 細胞死抵抗性 / inportinβ3 / PRMT6 / SMN exon7 / 変異マウス / 胚中心B細胞 / 長期生存抗体産生細胞 / アポトーシス

【研究成果の概要】

T細胞依存性抗原で刺激され活性化されたB細胞は胚中心を形成し、ここで高親和性記憶B細胞が産生される。産生された記憶B細胞は胚中心を離れ、長期の寿命を持って体内に維持され、二次免疫応答で迅速に抗体産生細胞に分化する。しかし、長期生存維持を司る分子機構は不明で、また、記憶B細胞の正確な組織局在やホーミングを司る分子は同定されていない。我々はこれまでに記憶B細胞で発現増強する遺伝子のクローニングを行ない、記憶B細胞で発現増強する多数の細胞内、細胞表面蛋白の遺伝子を同定した。解析の結果ヒト脊髄筋萎縮症の原因遺伝子であるSMN1遺伝子のマウスホモログが記憶B細胞及び胚中心B細胞に強発現し、試験管内で誘導されるアポトーシスを抑制する可能性が示唆された。更にSMN C末端領域はIgG1胚中心B細胞及び記憶B細胞の産生に必要であることが明らかにされた。また、獲得された遺伝子の解析から記憶B細胞がD6ケモカイン受容体を表面に発現することを明らかにし、記憶B細胞に高発現する新規遺伝子3940はERK6と相同性を有し、B細胞系列において記憶B細胞及び辺縁帯B細胞のみに高発現し、この遺伝子の発現が認められないB細胞株に強発現すると種々のアポトーシス培養条件下での細胞死に抵抗性を賦与されることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】15,000千円 (直接経費: 15,000千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】14370271 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Hyperthermia / Heat sensitization / SAPK / JNK / DNA-PK / wortmannin / p53 / U937 Cells / Cell death / Apoptosis / 温熱 / シグナル伝達 / p53 null / U937細胞 / 細胞死、アポトーシス / 温熱高感受性 / Akt / Wortmannin / リン酸化特異抗体 / 細胞死 / セラミド / 温熱療法

【研究成果の概要】

本申請では、温熱感受性のメカニズム、温熱応答、特に細胞死に至るシグナル伝達と応答遺伝子、タンパク質を明らかにする。そして温熱治療に有用な感受性修飾法の開発を長期目標とする。細胞の生死は、p53経路と別に、細胞の生存・増殖に関わるMAPK(Mitogen activated protein kinase),AKT経路と細胞死に関わるSAPK(Stress activated protein kinase)経路のバランスによって決定されるという仮説について、p53がnullで機能していないが温熱高感受性のU937細胞を用い、以下の解明を行った。
1)温熱応答に至るセカンドメッセンジャー分子、上流のシグナル伝達経路について解明
2)シグナル伝達に続き誘導される遺伝子群や応答タンパクのうち、温熱応答、特に細死感受性に関与する因子
3)温熱細胞死におけるDNA-PKの役割とwortmanninの温熱増感への関与のメカニズム
以上の研究の中で、温熱処理などでアポトーシスを誘導する細胞において、既知分子量とは異なる52kDa(p52)のJNKが誘導されてくること。p52JNKの発現誘導は、p54JNKの発現量減少と関係関係があること、更にp52は、P54JNKのカスパーゼ-3,7による分解産物であることをカスパーゼ阻害剤、p54JNKのアミノ酸置換体により証明した。細胞死に至る経路としてJNKの活性化によりc-Mycが急速に減少し、特異的inhibitorなどでc-Mycの減少を起こすと細胞死が起こることを証明した。wortmanninが示す温熱増感作用のメカニズムに関して、リン酸化部位特異抗体を用いたwestern blottingを中心にした実験やJNKのdominant negative作用をもつ変異細胞を用いた実験等からAKT経路の抑制ではなく、SAPK/JNK経路の活性化の増強によると考えられる結果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】12,800千円 (直接経費: 12,800千円)

【研究分野】病態科学系歯学(含放射線系歯学)

【研究領域課題番号】13557156 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / MAPキナーゼ / ASK1 / 細胞死 / 神経変性疾患 / 機能回復

【研究成果の概要】

歯科口腔領域において、三叉神経を中心とする知覚神経麻痺、および咀嚼運動障害は、癌、炎症、奇形などの病態発症およびその治療過程でしばしば起こる重篤な機能障害であると同時に、機能回復がきわめて困難な疾患の一つである。これらに対するアプローチとして、1)中枢および末梢の神経細胞の生と死の制御機構を解明する、2)失われた神経回路を機能的に再構築することの二点がきわめて重要と考えられる。まず1)に関しては、我々の最近の研究によって、神経変性疾患モデルにおける神経細胞死の分子メカニズムが明らかとなった。また2)については、我々が同定・機能解析してきたストレスシグナル応答性MAPキナーゼ「ASK1」が、ある一定の条件下において神経細胞の分化促進を誘導することを見いだしていると同時に、新たな実験系として神経幹細胞の初代培養および分化誘導系を確立しており、これらの研究成果をもとに、本研究は、神経細胞死の分子メカニズムの普遍性を解明し、臨床への応用を試みることを最終的な目標とした。その結果、ストレスを介した細胞死の病態モデルとしてポリグルタミン病についての解析を行い、ASK1がこの疾患の神経変性をメディエートするタンパク質の一つであることを初代培養細胞系を用いて明らかにするとともに、実際に疾患患者の脳においてASK1が活性化されていることなどを示してきた。さらに、これらの結果を個体レベルで確認するため脳の部位特異的にポリグルタミンを発現させるトランスジェニックマウスを作成し、ASK1ノックアウトマウスとの交配によりどのような表現型が得られるかを解析し、ASK1が神経変性疾患に必須の分子であることを証明しこれらの結果を論文に発表した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】14,100千円 (直接経費: 14,100千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13470053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 発生 / EAT遺伝子 / ES細胞 / コンディショナル・ターゲッティング / bcl-2ファミリー / 遺伝子改変マウス / EAT / bcl / mcl-1 / mcl1 / トランスジェニック・マウス / ミトコンドリア / 細胞死

【研究成果の概要】

EAT/mcl1遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EAT/mcl1の発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、胚性幹細胞(ES細胞)においてEAT/mcl1を欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行った。
Cre-loxPシステムを用いてEAT/mcl1遺伝子をマウス個体、ES細胞においてコンディショナルにノックアウトするために、EAT/mcl1のexon 1をloxPで挟むような変異を導入するターゲッティング・ベクターを導入することによりES細胞(TT2細胞)の一方の対立遺伝子に変異を導入することに成功した。11個のES細胞のクローンが得られ、5個のES細胞をマウス初期胚(胚盤胞)へ注入することによりキメラマウスを得た。それらより3ラインのマウスのラインを確立した。これらのマウスをCre recombinaseを発現するトランスジェニック・マウスと交配することにより以下のマウスを得た。1)EAT/mcl1のexon 1が破壊されたマウス(EAT/mcl1遺伝子1個のみ破壊されたヘテロ接合性のノックアウトマウスであり、表現形は、現在のところ、形態学的には野生形と同様と考えられる。このことはEAT/mcl1の発現量が通常の1/2となってもマウスは、正常に発生.分化することを示唆している)。2)EAT/mcl1のexon 1の両端にloxP配列が挿入されたマウス(このマウスは、両アレルとも正常なEAT/mcl1を有するが、臓器特異的Creトランスジェニック・マウスの交配により、コンディショナル・ノックアウトを作成することが可能である)。また、MEOXマウス(胎生5日目以降に、胚盤葉上層(将来、胎仔となる領域)特異的にCre recombinaseを発現するマウス)の導入を終了した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2004

【配分額】14,100千円 (直接経費: 14,100千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】13671933 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 細胞死 / 神経変性疾患 / ASK1 / MAPキナーゼ / 小胞体ストレス

【研究成果の概要】

細胞が正常に機能していく上で、遺伝情報に従って合成されたタンパク質が正しい高次構造を持つこと(folding:フォールディング)は必要不可欠である。しかしながら、細胞内で合成されたタンパク質のほとんどはいわゆる「不良品」であるといわれていると共に、細胞外的ストレスによってこの「異常タンパク質:unfolded protein」はさらに小胞体内腔に蓄積することとなり、細胞にとっては正常な機能獲得の妨げとなる。本研究では、ストレスシグナルの一つとして近年注目されている、小胞体ストレスによる細胞死の分子メカニズムを明らかにするため、これらのシグナル伝達経路における下流の標的遺伝子の同定を中心に研究をおこなうと同時に、小胞体ストレスという局面に着目した、細胞の生と死のメカニズムならびに分化・再生機構の分子メカニズムを明らかにした。すなわち、小胞体ストレスを介した細胞死の病態モデルとしてポリグルタミン病についての解析を行い、ASK1がこの疾患の神経変性をメディエートするタンパク質の一つであることを初代培養細胞系を用いて明らかにするとともに、実際に疾患患者の脳においてASK1が活性化されていることなどを示してきた。さらに、これらの結果を個体レベルで確認するため脳の部位特異的にポリグルタミンを発現させるトランスジェニックマウスを作成し、ASK1ノックアウトマウスとの交配によりどのような表現型が得られるかを解析し、ASK1が神経変性疾患に必須の分子であることを証明しこれらの結果を論文に発表した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】水産化学

【研究領域課題番号】12460092 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質過酸化 / リン脂質 / 細胞死 / ミトコンドリア / 膜電位 / 化学発光 / 蛍光 / 筋肉 / 脂質酸化 / アポトーシス

【研究成果の概要】

水産動物でも,個体死の後も細胞はしばらくの間生体活動を続けようとする.したがって,この間の取扱がその後の死後変化に大きな影響を及ぼす可能性がある.そこでまず,水産動物の個体死から細胞死に至る過程で生じる生物学的・化学的変化をモニターする手法を確立した.すなわち,本年度研究では,これらの手法を用いて生物学的・化学的変化をモニターすることにより,細胞死過程における動的変化の発現機構の解明とこれらの技術を応用した新たな鮮度判定法の確立を目指した.まず,生物学的アプローチとして急性摘出した魚類筋細胞ミトコンドリアおよび甲殻類筋細胞ミトコンドリアに膜電位感受性蛍光プローブJC-1あるいはrhodamine123を取り込ませてミトコンドリア膜電位の評価を行った.急性摘出したコイの筋細胞にJC-1を取り込ませた後,4時間まで窒素曝気したリンゲル液中においたところ,経時的に蛍光強度が減弱した.これは,低酸素状態に置かれたミトコンドリアの膜電位が低下し,ATP産生能も低下していることを示す.この細胞を十分に空気曝気したリンゲル液に戻すとミトコンドリアの蛍光が回復した.すなわち,コイ筋細胞は4時間もの間低酸素状態に置かれても少なくともミトコンドリアレベルでは生命維持活動が可能であることを示すものと思われる.また,イセエビ筋細胞にRohdamine123を投与し,ミトコンドリアに取り込ませた後,リンゲル液に十分通気しておけばミトコンドリア膜電位が少なくとも24時間以上維持される可能性が示された.このように,ミトコンドリアの膜電位およびその回復能をもって生命維持活性の評価ができるものと考えられた.さらに,12年度に確立した化学発光HPLCフローシステムを用いて,活魚の鮮度変化について検討した.ヒラメやマダイなどを即殺後,普通筋,血合筋,肝臓などの部位に分け,ホモジネート後、0℃で保存試験を行った.経時的にFolchの方法に準じて全脂質を抽出し,低温下で溶媒を留去後,過酸化物の定量分析を行った.HPLCフローシステムによる測定では,筋肉脂質よりも肝臓脂質の方が高い傾向が示されたが,リン脂質過酸化物の定量に再現性が乏しく,時間経過との相関はみられなかった.原因は全脂質中のリン脂質画分の低濃度にあると推定された.以上の結果から,細胞死をモニターするという新しい概念に基づいた鮮度判定手法として,ミトコンドリア膜電位測定および脂肪酸過酸化物の微量測定が適用できるものと結論された.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】14,200千円 (直接経費: 14,200千円)

【研究分野】食品科学・製品科学

【研究領域課題番号】10306008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

食品アレルギー / TCRアンタゴニズム / 変異ペプチドリガンド / 腸管免疫系 / サイトカイン / 神経細胞 / 一酸化窒素 / アポトーシス / アナログペプチド / 脳細胞 / T細胞 / 細胞死 / p53 / IgE / 神経幹細胞

【研究成果の概要】

1.アレルゲンの分子構造変化と免疫応答の関係 T細胞抗原レセプタートランスジェニック(TCR-Tg)マウスのT細胞が認識する卵白アルブミン(OVA)の部分ペプチドOVA323-339の1残基置換アナログ40種は、それが誘起するT細胞のサイトカイン応答や抗体産生誘導のパターンの違いにより、4つの群に分けることができた。同様のパターン変化はOVA323-339濃度の変化によっても観察された。さらに、T細胞応答を抑制するアナログも同定し、これの腹腔内投与はinvivo食品アレルギー反応モデルにおいて抑制効果を示すことを明らかにした。
2.アレルゲンと腸管免疫系の応答作用OVAを経口投与したTCR-Tgマウスのパイエル板細胞は抗原刺激に対しIFN-γ、IL-5を分泌し、腸管上皮内リンパ球はIFN-γを分泌した。一方、脾臓CD4T細胞のサイトカイン産生能は減弱し、経口免疫寛容が誘導された。この寛容T細胞において、TCR刺激に対する細胞内Ca^<2+>濃度の上昇等に障害が認められた。また、OVA経口投与により胸腺細胞、各リンパ組織のCD4T細胞のアポトーシスが観察され、p53欠損マウスにおいて抗体レベルの経口免疫寛容が部分的に解除された。パイエル板細胞の抗原提示能と脾臓細胞の抗原提示能の違いについて明らかにした。
3.腸管免疫系と神経系の相互作用 神経幹細胞の培養系を用い、神経系細胞に対するサイトカインの作用を解析した。IL-6ファミリーサイトカイン(IL-6,IL-11)およびTGF-βファミリーサイトカイン(BMP-2,BMP-4)の作用により、神経細胞の活動を補助するグリア細胞の新生が誘導された。また、免疫系のストレス応答により誘導型-酸化窒素合成酵素の発現が誘導され、結果的に周囲に存在する神経細胞が傷害され、場合によってはp53依存的にプログラム細胞死が誘起されることが判明した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】37,100千円 (直接経費: 37,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09780648 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョウバエ / 細胞死 / 線虫 / アポトーシス / プロテアーゼ / ICE / Bcl-2 / 酵母

【研究成果の概要】

CED-4はcaspaseの活性化因子として細胞死の実行に深く関与している。CED-4の機能解析を生化学的・分子遺伝学的に行うことを目的としてショウジョウバエを用いたCED-4の機能評価系を確立した。ショウジョウバエ由来の培養細胞であるS2にCED-4を過剰に発現させることによってcaspaseの活性化を伴う細胞死を誘導することが出来た。CED-4によって活性化されるcaspaseをaffinitylabelによって同定した結果、dr ICEが活性化されていることが明らかになった。免疫沈降実験によって細胞内ではCED-4とdr ICEが複合体を形成することが明らかになり、caspaseとの直接の相互作用がその活性化に必要であることが示唆された。また、CED-4内のP-loop motifがcaspaseの活性化に重要であり、P-loopmutationはdominant negativeにCED-4による細胞死を抑制した。ショウジョウバエ複眼に過剰発現させたCED-4はcaspaseの活性化を伴った細胞死を誘導し、生体でのCED-4の機能を評価する系が確立された。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】09044264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / サイトカイン受容体 / シグナル伝達 / アポトーシス / 造血 / 生殖細胞 / 血管内皮細胞 / 発生 / オンコスタチンM / 血管内皮 / セルトリ細胞 / 始原生殖細胞 / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 白血病

【研究成果の概要】

造血細胞の生存はサイトカインに依存しており、サイトカイン除去により細胞死が誘導される。我々はすでにこのサイトカインによる細胞死抑制機能にはサイトカインにより活性化されるRASが重要であることを示した。そこで、RASの変異体を用いてRAS下流のシグナル経路の解析を行い、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を介して細胞死を抑制していることを明かにした。一方、サイトカイン非存在下ではCaspase-3が活性化され、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることも明らかにした。また、我々はサイトカインで誘導される分子としてオンコスタチンM(OSM)を同定していたので、その機能を検索した。造血発生の場として知られている胎生期のAGM(aorta/gonad/mesonephros)領域にOSMの発現を認め、マウスAGM領域の細胞を培養する系にてOSMが血球産生と血管内皮細胞の増殖を促進することを見いだし、OSMが血球と血管内皮に共通の前駆細胞hemangioblastsに作用する可能性を示した。さらに、この培養系を用いて、血球産生に必須な転写因子c-myb,AML-1の作用を解析した。また、OSMは生殖細胞とセルトリ細胞にも作用することを見いだした。さらに、マウスOSM受容体の生化学的解析およびマウスOSM受容体遺伝子クローニングにより、機能的な受容体の分子構造を明らかにし、ヒトOSMとの相違を明らかにした。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】5,500千円 (直接経費: 5,500千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】09470245 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

好中球 / アポトーシス / ネクローシス / 感染 / サイトカイン / 活性酸素 / 成長ホルモン / CD16 / 炎症性メジエータ / 外科侵襲 / 細胞死 / apoptosis / necrosis / 接着分子

【研究成果の概要】

本研究は、炎症・感染における好中球細胞死とその炎症遷延・臓器障害発生における役割の詳細を明らかにし、さらに重症炎症・感染時の好中球ネクローシス防止、アポトーシス誘導などの対策を開発することを目的とする。本年度は、以下のような研究成績を得た。
1、 健常成人の好中球を各種比率の細菌と混合培養した。フローサイトメトリー、光学顕微鏡、電気泳動法により好中球細胞死を測定した。また、活性酸素産生能とCD16(IgG FcレセプターIII)発現能も測定した。好中球は細菌量が少ない場合はアポトーシス優位で、細菌数が多い場合はネクローシスの形態で細胞が死んだ。細菌の混合比率が高いほど、活性酸素産生能は増強され、CD16発現能は低下した。
2、 健常成人の好中球を各種サイトカイン(TNF-α、IL-Iβ.IL-6、IL-8、GM-CSF、IL-10)と培養し、好中球細胞死を測定した。低濃度TNF-αは単独培養に比べ好中球アポトーシスを抑制、高濃度では誘導を促進した。IL-1β,IL-6、GM-CSFは好中球アポトーシスを抑制した。IL-10はIL-6の好中球アポトーシス抑制効果を減弱した。
3、 健常成人の好中球をGHで前処理、その後好中球細胞死、活性酸素産生能を測定した。GHは好中球アポトーシスを抑制した。GHは好中球活性酸素産生能も増強した。
4、 外科手術患者の末梢血を術前、術後第1-7日目に、腹腔ドレーン排液を術後1-3日目に採取し、好中球細胞死を測定した。また、好中球活性酸素産生能とCD16、TNFレセプター発現能も測定した。末梢血の好中球アポトーシスは術後1日目から術後3日目において抑制され、術後7日目には回復した。腹腔ドレーン排液中の好中球アポトーシスも術後1日目では極めて抑制され、その後に回復した。術後局所の好中球アポトーシスが抑制されているほど、活性酸素産生能が亢進していた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】13,000千円 (直接経費: 13,000千円)

【研究分野】環境影響評価(含放射線生物学)

【研究領域課題番号】08680566 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

メダカ / アポトーシス / 紫外線 / 光回復酵素 / 細胞死

【研究成果の概要】

これまでの研究者では,紫外線誘発アポトーシスは紫外線による膜損傷から誘導されるという知見が得られていた.光回復酵素遺伝子を過剰発現させたメダカ培養細胞OCP13を用いることにより,短時間(分単位)の可視光照射で,致死線量の紫外線により生成されたピリミジン二量体のみを,ほぼ完全に修復することに成功した.
この細胞では紫外線照射後4時間で,アポトーシスに特徴的な決定変化やDNA断片化などが現れ,アポトーシスを観察しやすく,次の2点が明らかとなった.(1)紫外線誘発アポトーシスの過程は,DNA断片化が起こる直前までは可逆的である.(2)アポトーシスの主要因であるピリミジン二量体が修復されさえすれば,途中まで進行したアポトーシスカスケードから細胞は離脱できる.
UVA,UV B,UVCが誘発するアポトーシスの違いを,比較した.UVA,UVB,UVCを照射した.UVB(50-800J/m^2)とUVC(10-30j/m^2)では,照射後4hrで均一に播種した細胞の配置は網目状に変化した.その後細胞と核の萎縮,核小体数の減少,アポ小体の形成などの形態変化が観察された.接着面から剥離した細胞からはDNA断片化が検出され,アポトーシスを起こしていることが明らかになった.一方,UVA(4 kJ-24 lJ/m^2)では,細胞と核の萎縮,核小体数の減少は起きたが,アポ小体の形成は観察されず,細胞の配置は均一なままだった.照射により萎縮した核は,UVBやUVCでは,いびつだったの対し,UVAでは丸かった.UVBとUVCは、細胞にアポトーシスに特徴的なカスパーゼ活性化が認められたがUVAでは、これが観察されなかった。
これらの結果よりUVAでは、細胞死の引き金となる損傷が、ピリミジン2量体でないばかりでなく、下流の情報伝達系も異なることが考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07559018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 造血因子 / RAS / STAT / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 造血 / JAK / レトロウイルス / アポトーシス / サイトカイン受容体 / JAKキナーゼ / 転写因子 / 分化

【研究成果の概要】

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。
サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。
IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。
優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)