【研究領域課題番号】20K07378 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TFFファミリー / バイオマーカー / アポトーシス / abortive cell cycle / 増殖抑制 / 浸潤能 / Trefoil factor / 肺癌 / mTOR / 転写制御 / AKT / microRNA

【研究成果の概要】

我々は培養細胞とヒト肺癌でTrefoil factor (TFF) family蛋白質の機能解析を行っている。これまでの基盤研究で、i) TFF1の腺癌細胞特異的な発現、ii) TFF1過剰発現による細胞増殖抑制、細胞死の亢進、iii) 肺癌患者における血清TFFの高値、等を明らかにした。本年度は培養細胞でTFFの発現による遊走、浸潤の変化、ヒト肺癌組織での発現様式を解析した。[方法]　1. TFF1の構成的過剰発現培養細胞株を樹立し、TFF1の細胞増殖に及ぼす影響を細胞数計測とCKK assayで検索した。またsiRNAも用いて遊走能の変化をscratch assay、浸潤能をmatrigelで解析した。2. flow cytometryによりTFF1発現細胞の増殖と細胞死の機序を解析した。3. 肺癌組織100例における免疫組織化学的発現を検索し、患者血清、尿のTFF1-3レベルと比較検討した。[結果]1. TFF1発現株では小細胞癌(SBC5)、扁平上皮癌(LC-AI)いずれでも遊走能、浸潤能は抑制され、これは特異的siRNAの導入で回避された。2. FACS解析ではTFF1導入により細胞周期の回転は促進されるがアポト－シスの亢進によるabortive cell cycleで、結果的に増殖は抑制された。3. 血清、尿のTFF1-3の組み合わせにより癌患者をAUC=0.825という高値でスクリーニングできた。4. またTFF1, TFF2はpTis/pT1, pN0/1とう早期癌患者で高く、一過性の上昇を示す結果であった。5.患者手術材料のTFF1-3に関する免疫染色ではTFF1-3は全組織型の肺癌組織で発現を認め、TFF1,3は血清レベルと相関したが、TFF2は逆相関した。 [結論] TFF1は肺癌では増殖、浸潤能に抑制性に機能し、臨床病理学的にもTFFsは有力な肺癌のバイオマーカーとなる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】21659350 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Bcl-2 family / 破骨細胞 / Bcl-2 / Mcl-1 / Bisphosphonate / Erk / Akt / Apoptosis

【研究成果の概要】

我々はこれまでにpro-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBimのノックアウトマウスでは破骨細胞の生存期間は延長しているが骨吸収活性は低下していること、一方anti-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBcl-xの破骨細胞特異的ノックアウトマウスにおいては破骨細胞の生存期間が短縮する一方で骨吸能が亢進していることを明らかにした。本年はあらたなBcl-2ファミリー分子であるMcl-1に注目して破骨細胞における役割を検討した。Mcl-1はBcl-2 familyに属する蛋白の1つであり、様々な細胞においてアポトーシスを抑制する働きを持つことが知られている。M-CSF,RANKL,TNF-alpha,IL-1等の添加によって破骨細胞におけるMcl-1発現の増加がみられ、さまざまな骨代謝疾患や炎症性疾患においてMcl-1が関与している可能性が示唆された。プロテアソーム阻害剤MG132添加によって破骨細胞におけるMcl-1の発現は上昇し、免疫沈降法によりMcl-1がユビキチン化されることが確認された。このことより、破骨細胞のMcl-1の代謝にはユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク分解系が関与していると考えられた。レトロウイルスやアデノウイルスを用いてMcl-1の発現量を増加させた破骨細胞の細胞生存能は亢進したが、骨吸収能は低下した。これとは逆にMcl-1の発現量をノックダウンやノックアウトによって減少させた破骨細胞の細胞生存能は低下し、骨吸収能は亢進した。以上の結果より破骨細胞においてMcl-1は細胞生存能に対しては正の制御を行うが、骨吸収能に対しては逆に負の制御を行う事が明らかになった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】17390410 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨 / 骨密度 / Akt / 骨粗鬆症 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / ノックアウトマウス / アポトーシス / 軟骨 / 成長板 / 石灰化 / インスリン / 軟骨内骨化

【研究成果の概要】

本研究は、骨形成作用を持つインスリン/IGF-Iシグナルを細胞内で促進的に伝達するAktの骨代謝調節における生理的な役割・分子メカニズムを明らかにする目的で、Aktlホモノックアウトマウス(Aktl-/-)の解析を行い、下記の結果を得た。
(1)骨芽細胞や破骨細胞ではAktlの発現が最も優位であったことより、Aktl-/-マウスの骨格系に関する表現型を検討すると、海綿骨と皮質骨ともに骨量が減少していた。骨組織形態計測ではAktl-/-マウスでは骨芽細胞数の減少とともに骨形成が低下しており、TUNEL染色では骨芽細胞のアポトーシスが亢進していた。
(2)骨芽細胞の生存/アポトーシスにおいて、Aktlシグナルは、転写因子Fox03aをリン酸化してその核内局在を阻害することにより、ミトコンドリア経路のアポトーシス促進因子であるBimの転写・発現を抑制することによって、アポトーシス抑制的に作用していた。また、Aktlシグナルは骨芽細胞分化に必須の転写因子Runx2のDNA結合を促進することにより、Runx2を介する骨芽細胞分化と石灰化を促進する作用を持つことが示された。
(3)骨吸収を担う破骨細胞ではAktlが細胞自律的に分化と生存に促進的に働いていた。また、破骨細胞の形成を支持する骨芽細胞ではAktlがreceptor activator of nuclear factor-κB ligandの発現を促していた。
本研究により、Aktlは骨組織において骨芽細胞や破骨細胞の分化・生存を促進し、骨形成と骨吸収を正に制御しながら骨量を維持する重要な役割をはたしていることが明らかとなった。Aktlは生体内ではユビキタスに発現しており、機能も多彩であるため、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患の治療標的分子とはなり難いが、Aktlに関連する分子ネットワークのさらなる検索が骨疾患のより良い治療へと繋がるものと期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,310千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 810千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16390432 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

破骨細胞 / Rac1 / M-CSF / Akt / アポトーシス / 低分子量Gタンパク質 / アデノウイルスベクター / 骨吸収

【研究成果の概要】

破骨細胞は最終分化した増殖能のない細胞であり、一旦分化するとreceptor activator of NF-kB ligand(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)などの生存因子が存在しないと速やかに細胞死に至る。破骨細胞の細胞死はアポトーシスによるものであることが報告されている。アポトーシスは「プログラムされた細胞死」とも呼ばれ、細胞への様々な刺激、あるいはストレスなどによって誘導され、DNAの断片化を特徴とする静かな細胞死である。近年破骨細胞の細胞死はアポトーシスによることが明らかになってきたが、このように骨代謝の要ともいえる破骨細胞がなぜアポトーシスに陥りやすいのか、またその分子メカニズムはいかなるものか、などについてはほとんど明らかになっていないのが現状である。ビスフォスフォネートは強力な骨吸収抑制作用を有する骨粗鬆症治療薬であるが、その作用メカニズムとして破骨細胞のアポトーシス誘導が知られている。われわれはこれまでにsmall G proteinのひとつであるRasが破骨細胞の生存に重要であり、Rasの活性を抑制するdominant negative Ras遺伝子の導入によって破骨細胞は速やかにアポトーシスに陥り、Ras-ERK経路を活性化するconstitutively active MEK1の導入によってアポトーシスが強力に抑制されることを明らかにした。やはりsmall G proteinであるRhoファミリーに属するRac1はラメリポディアの形成などアクチン細胞骨格の制御に重要な働きをすると考えられているが、ある種の細胞ではアポトーシスシグナルに関与することが明らかになっている。われわれは破骨細胞のアポトーシスにおけるsmall G protein、なかでもRho,Rac,Cdc42といったRhoファミリーの役割を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】9,600千円 (直接経費: 9,600千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】15591715 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腎細胞癌 / サイトカイン / アポトーシス / NF-κB / C / EBP / AP-2 / MAPキナーゼ / Akt / EBP-β

【研究成果の概要】

サイトカインのシグナル伝達に関連した転写因子に着目して腎細胞癌の細胞生物学的特徴を明らかにした。一連の研究は腎細胞癌が頻繁に発熱や白血球増多症を伴い、サイトカイン産生性腫瘍であるという臨床的特性に対する分子基盤を与える研究と位置づけられる。腎細胞癌の組織においてはNF-κBの活性化は腫瘍の進展や転移と関連すること(Oya M et al : Carcinogenesis 2003)、CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)の活性化は腎細胞癌においてはβサブタイプに依存していること(Oya M et al : Clin Cancer Res 2003)を示した。これら2つの転写因子の活性化は癌の悪性度や浸潤と相関するのに対し、Activator protein 2(AP-2)は逆に早期の腎細胞癌に有意に活性化が見られることを示した(Oya M et al : Urology 2004)。さらに腎細胞癌のアポトーシスの誘導機構を利用して治療への応用を試みた。Mitogen-activated protein kinase(MAPK)とphosphatidylinositol-3-OH kinase(PI3K)-Akt経路の意義を中心に解析した。MAPKは主にERK,JNK,p38の経路に分類される。腎細胞癌においてはJNKの活性化を負に制御するフォスファターゼであるMKP-1の発現の亢進が存在し、JNKの活性化はすみやかに抑制されること、JNKの活性化を持続させることにより腎細胞癌においてアポトーシスが誘導されることを示した(Mizuno R et al : J Urol 2004)。また、プロテアソーム阻害剤が腎癌細胞にアポトーシスを誘導することを示した(Ishizawa J et al : Int J Oncol 2004)。PI3K-Akt経路の解析では免疫組織化学的手法にてAktの活性化が腎細胞癌の予後不良因子であることを示した(Horiguchi A et al : J Urol 2003)。これらの成果は分子標的治療への応用が期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】14370271 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Hyperthermia / Heat sensitization / SAPK / JNK / DNA-PK / wortmannin / p53 / U937 Cells / Cell death / Apoptosis / 温熱 / シグナル伝達 / p53 null / U937細胞 / 細胞死、アポトーシス / 温熱高感受性 / Akt / Wortmannin / リン酸化特異抗体 / 細胞死 / セラミド / 温熱療法

【研究成果の概要】

本申請では、温熱感受性のメカニズム、温熱応答、特に細胞死に至るシグナル伝達と応答遺伝子、タンパク質を明らかにする。そして温熱治療に有用な感受性修飾法の開発を長期目標とする。細胞の生死は、p53経路と別に、細胞の生存・増殖に関わるMAPK(Mitogen activated protein kinase),AKT経路と細胞死に関わるSAPK(Stress activated protein kinase)経路のバランスによって決定されるという仮説について、p53がnullで機能していないが温熱高感受性のU937細胞を用い、以下の解明を行った。
1)温熱応答に至るセカンドメッセンジャー分子、上流のシグナル伝達経路について解明
2)シグナル伝達に続き誘導される遺伝子群や応答タンパクのうち、温熱応答、特に細死感受性に関与する因子
3)温熱細胞死におけるDNA-PKの役割とwortmanninの温熱増感への関与のメカニズム
以上の研究の中で、温熱処理などでアポトーシスを誘導する細胞において、既知分子量とは異なる52kDa(p52)のJNKが誘導されてくること。p52JNKの発現誘導は、p54JNKの発現量減少と関係関係があること、更にp52は、P54JNKのカスパーゼ-3,7による分解産物であることをカスパーゼ阻害剤、p54JNKのアミノ酸置換体により証明した。細胞死に至る経路としてJNKの活性化によりc-Mycが急速に減少し、特異的inhibitorなどでc-Mycの減少を起こすと細胞死が起こることを証明した。wortmanninが示す温熱増感作用のメカニズムに関して、リン酸化部位特異抗体を用いたwestern blottingを中心にした実験やJNKのdominant negative作用をもつ変異細胞を用いた実験等からAKT経路の抑制ではなく、SAPK/JNK経路の活性化の増強によると考えられる結果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】12,800千円 (直接経費: 12,800千円)