Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

幹細胞 / 神経成長因子 / 遺伝子導入 / アデノウイルス / がん幹細胞 / 神経膠腫 / SP細胞

幹細胞への外来遺伝子の導入に必要な諸条件を検討した。この際、骨髄由来間葉系幹細胞を標的細胞として用い、幹細胞のマーカーとして、CD271に着目した。CD271は神経成長因子受容体(NGFR)であるが、未分化性を維持させる分化制御因子としての作用を有する。間葉系幹細胞として、イヌ骨髄液から磁気ビーズ法によりCD271陽性分画を回収し、この細胞集団が高い増殖性と未分化性を維持していることを確認した。また、前年度開発した相同組換えを応用したアデノウイルスゲノム上への外来遺伝子挿入技術を応用し、筋分化誘導因子であるMyoD発現ベクターを構築した。このベクターを分化誘導スイッチとして用い、間葉系幹細胞で一過性にMyoDを強制発現することにより、簡便な細胞分化誘導方法を確立した。この際、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を併用することによって、分化誘導効率が改善できることを見出した。まず、分化誘導細胞をマウス骨格筋に移植し、移植細胞の生着を確認した。同時に、炎症制御因子IL-10を局所的に作用させると移植効率が向上することを確認した。さらに、ビーグル犬を用いて同種移植を実施した。リンパ球抗原の一致した個体間でドナーとレシピエントを選定し、分化誘導因子遺伝子を導入したドナー由来細胞をレシピエントの前肢および後肢に局所移植したところ、移植細胞は移植領域に3ヶ月間にわたり生存・生着していることが確認できた。生着細胞は筋線維様の形態を示しており、分化マーカーの発現様式から組織再生過程にあることが示唆された。

アデノ随伴ウイルス / 染色体部位特異的遺伝子組込み / Rep / AAVS1 / 幹細胞 / アデノウイルスベクター / CAR / c-Kit / 染色体遺伝子組込み / アデノウイルス

AAVの二つのコンポーネント(ITR配列とRep蛋白質)を利用し、第19番染色体長腕AAVS1領域に遺伝子を組み込ませる方法の応用開発を推進した。これまでにITR配列連結マーカー発現ユニットを構築し、切り出されたstuffer配列中のITRにRepが結合することによって、第19番染色体AAVS1領域に遺伝子組込みが生ずることを検討した。HeLa細胞を用いて、Southern blot解析によるAAVS1領域の遺伝子再構成とマーカー遺伝子のAAVS1領域特異的遺伝子組込み様式を確認した。
さらに、ITR配列連結マーカー発現ユニットとRep発現誘導カセットを有するアデノウイルスベクターの応用を念頭に、アデノウイルスベクターの幹細胞への吸着を仲介するアダプター分子を開発した。アデノウイルスベクターに親和性のあるCARと幹細胞に発現するc-Kitのリガンド分子である幹細胞因子(SCF)を連結した、可溶性融合蛋白質CAR-SCFを構築し、その効果を検討した。CAR陰性c-Kit陽性の細胞株M07eへのeGFP発現Adベクター遺伝子導入(MOI 50)において、CAR-SCFを培養液に添加することでeGFP陽性率は0.5%から78%に向上した。ヒト臍帯血CD34^+細胞を用いた検討でも、9.8±3.7%から17.5±2.5%に改善された。CAR-SCFはc-Kit陽性細胞へのアデノウイルスベクター遺伝子導入効率を向上させ、これを用いた幹細胞へのAAVS1領域特異的遺伝子組込みへの応用が期待される。

【研究分担者】
小澤敬也 (小沢敬也)	自治医科大学	医学部	教授	(Kakenデータベース)
卜部匡司	自治医科大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)