Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

脳・神経 / 酵素 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 生体分子 / カルシウム / キナーゼ / 低分子量GTP結合蛋白質 / アクチン

本研究では、Rho活性やカルシウム流入のより生じる神経アクチン細胞骨格などの再編成機構と、その下流の生理作用などについて探索した。
まず樹状突起形成・伸展を制御するCaMK分子種を調べた。大脳皮質培養細胞の樹状突起形成は、CaMKIα、CaMKIIやCaMKIVのRNAiでは全く阻害されず、CLICK-III/CaMKIγのRNAiのみ顕著な短縮とRac活性の低下が明らかとなった。さらなる実験から、CLICK-III/CaMKIγ一STEF-Rac経路の重要性が示された(Takemoto-Kimura et al.改訂中)。
続いて、CaMK類似キナーゼであるCLICK-I/DCAMKL1およびCLICK-II/DCaMKL2の樹状突起形態に対する影響を調べたところ、doublecortin領域を有するアイソフォームでは、過剰発現により微小管bundlingを起こすが、アクチン骨格への大きな影響は見られなかった(Ohmae et al. J. Biol. Chem. 2006)。
上記の過程で、lipofection、adenovirus、遺伝子銃による遺伝子導入法の最適化を行い、スパインにおけるPSD-95変異体の機能異常(Nonaka et al.,J. Neurosci.,2006)や、アクチン線維・カルシウム流入による海馬・Purkinje細胞樹状突起における、cortactinやShankの局在変化を明らかにした(Iki et al.,Eur. J. Neurosci. 2005; Fuse et al.準備中)。
さらに、幼弱細胞の移動時にはRho-mDial依存的アクチン骨格再編成により、ApcやSrcの複合体の位置が制御されていることを解明した(Yamana et al. Mol. Cell Biol. 2006)。

カルシウム / アクチン / Rho / キナーゼ / 小脳顆粒細胞 / 海馬錐体細胞 / calcium / リン酸化 / CaMK / actin / ROCK / mDia / 軸索

1.我々は、小脳顆粒細胞という、神経細胞の中でももっとも数が多い細胞種を材料に、Rhoの上流と下流のシグナル伝達系を解明することを試みた。SDF-1α/CXCR4による小脳顆粒細胞の形態制御とRho情報伝達系の関与について検討した結果、SDF-1α/CXCR4/Rho/mDia1経路が小脳顆粒細胞の軸索伸展を制御していることが明らかとなった。具体的には、軸索伸展の正の制御にmDia1が必須であることが証明された。すなわち、Rhoは、2つの標的分子ROCKとmDia1を協調的に制御することにより、軸索突起形成・伸展がバランスよく生じ、回路網形成のために最適な条件を生み出している可能性を示唆するものである。
2.我々は、これまで海馬錐体細胞において、カルシウム依存的に樹状突起へのアクチン集積が起こることを見出している。しかしながら、アクチン集積からスパイン形態変化へ確実に移行するのか、そのときにカルシウムの下流で作用するシグナル伝達系は何か、RhoGTPaseファミリーは関与するのか、といった点については、全く未解明である。我々は、CREB kinase候補遺伝子CLICK (CaMK-like CREB kinase)-IIIを、中枢神経系では初の膜結合型キナーゼとして単離同定した。さらなる解析の結果、C末端CAAXモチーフを介してprenyl化修飾を受けること、またCaMKKによる活性化制御を受けることを明らかにした。引き続き、本キナーゼの解析を行い、PC-12にてCaMKK/CLICK-III経路が突起形成に関与すること、またその下流で特定のG蛋白の活性が増大することなどが明らかになった。

Rho / mDia / 小脳顆粒細胞 / 軸索 / 突起伸展 / calcim / Camキナーゼ / CREB / calcium / CaMキナーゼ / actin / シナプス / 成長円錐 / 突起進展

1)Rho標的分子mDiaの軸索伸展における役割の解明
神経回路網におけるシグナル伝達分子の空間的制御の背景には、細胞膜や分子局在の非対称性を生み出すダイナミックな細胞骨格再編成が存在するが、その詳細は明らかではない。そこでわれわれは、最も数多く存在する神経細胞である小脳顆粒細胞に着目して、まず極性が生じ、2本の軸索がまず伸展し始め、その後に細胞体周辺に数多くの樹状突起が発生する過程で、低分子量G蛋白質Rhoを介したシグナル経路の役割を探索した。
マウス生後一日令小脳より小脳顆粒細胞初代培養を起こし、Lipofection法による遺伝子導入により、試験管内軸索形成・突起伸展におけるRho標的分子ROCK、mDiaの機能解析を行った。その結果、変異体cDNAのトランスフェクションにより、1)ROCKのRho結合キナーゼとしての活性を阻害すると軸索形成が促進され、成長円錐ダイナミクスが亢進すること、さらに2)mDia1は、Rho下流のアダプター分子として軸索形成・突起伸展を促進させる活性を有することが明らかになった。これらの実験の結果、細胞骨格再編成による軸索伸展にはRho GTPaseの下流にある複数のエフェクターの協調が必要であることが示唆された。これらの解析を発展させることにより、分化神経細胞を目的部位に移動させ、軸索伸展やシナプスを促進させるという、生理的分子機序に基づく機能的な神経再生という新たな治療戦略が期待できる。
本成果は、J. Cell Biol.誌に印刷中である。
2)新規CREBキナーゼ候補遺伝子CLICK-IIIの同定・クローニング
転写因子CREBは、記憶学習などの長期的現象の際に遺伝子発現を介して神経細胞における長期的な変化を誘導すると考えられている。CaM kinase IV類似の新規CREB kinaseのクローニングを試みCREB kinase候補遺伝子CLICK(CaMK-like CREB kinase)-IIIを同定し全長塩基配列を決定した。CLICK-IIIはin vitroにおいてCa2+/CaM依存性に活性化され、CREBSer133をリン酸化することを明らかにした。興味深いことにCLICK-III mRNAは神経系で強く発現しており、脳内では大脳辺縁系、間脳の限られた神経核で特に多く存在することがin situ hybridization法により明らかとなった。このような発現パターンは他のCaM kinaseと異なっており、高次脳機能における新たな働きを担っている可能性が示唆される。
本成果はJ. Biol. Chem.誌にてrevise中である。

卵成熟 / 成熟促進因子 / 付活 / 細胞質分裂 / 紡錘体 / 染色体運動 / アクチン / 減数分裂 / 卵成熟促進因子 / 人工受精 / カルシウム / 分裂装置 / 細胞分裂 / 核分裂 / 発生開始 / 細胞周期

1.卵成熟・発生開始の機構:
(1)Ca緩衝液やイノシトール三燐酸の細胞内注入により、マウスの未受精卵を付活させることができ、15μM以上の細胞内Ca濃度で、減数分裂が再開・完了することがわかった。
(2)成熟促進因子(MPF)は燐酸化で活性化されたタンパク質であるという説に否定的な結果を得た。ヒトデの成熟卵から成熟を誘起するmRNAを得た。これにはサイクリンと相同な塩基配列が存在した。
(3)カエル卵の減数分裂に伴うMPFの出現は卵核胞に依存しない。卵核胞のない卵でみられるMPFの出現は、表面収縮波の出現・卵の「かたさ」の上昇と同期した。
(4)人工付活の際にゼノパス卵で見られるCa波と同じものが、卵の受精の際にも検出された。
(5)人工付活ヒトデ卵の中心粒が紡錘体形成に関わるときの動きを調べた。
(6)細胞周期の開始に関わる卵前核の役割を示唆された。
2.染色体運動の機構:
(1)後期染色体運動にはATPが必要であることを、生細胞への顕微注射により確認した。
(2)染色体運動の原動力は、染色体に近接した半紡錘体中に局在することがわかった。
(3)誘導された半紡錘体についての観察から、中心体・星状体は、紡錘体形成には必要だが、後期染色体運動には必要でないことが示唆された。
3.細胞質分裂の機構:
(1)テトラヒメナのアクチン遺伝子を同定し、アクチンのアミノ酸配列を推定した。従来のアクチンとは75%相同で、生化学的性質も異なるが、生物学的機能は同一であった。
(2)両生類卵で分裂溝形成の準備が完了するのは、離層が表層に達した時であることがわかった。
(3)アクチン繊維に結合するウニ卵の調節タンパク(スペクトリン・20K蛋白・100K蛋白・255K蛋白・45K蛋白・デパクチン)の特性がわかった。分裂溝を単離し、その収縮を誘導することに成功した。
(4)分裂周期に伴うCa^<2+>の変化を調べた。

【研究分担者】
浜口幸久	東京工業大学	理学部	助教授	(Kakenデータベース)
馬渕一誠	東京大学	教養学部	助教授	(Kakenデータベース)
平本幸男	放送大学	教授	(Kakenデータベース)
沢井毅	山形大学	教養部	教授	(Kakenデータベース)
片桐千明	北海道大学	理学部	教授	(Kakenデータベース)