【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】16380072 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自家不和合性 / 情報伝達 / アブラナ科 / リン酸化 / キナーゼ / MLPK / ミリストイル化 / アブラナ科植物

【研究成果の概要】

本研究は、アブラナ科植物の自家和合性変異株の原因遺伝子として新たに見出された膜アンカー型細胞質キナーゼMLPKに着目し、自家不和合性の情報伝達系におけるMLPKの機能を解明することを目的として行った。主要な研究成果は、以下の通り。
1.MLPKの発現様式の解析
MLPK遺伝子が翻訳開始点を異にする2種類の転写産物を生産すること、1種類は主に柱頭で、もう1種類は多くの組織で発現していることを明らかにした。また、いずれも異なる様式で細胞膜上に局在すること、この膜局在性が自家不和合性の情報伝達に必須であることを明らかにした。
2.MLPKの活性化機構の解析
MLPKがSP11を認識するSRKと受容体複合体を形成している可能性は低く、SRKの下流の情報伝達系で機能している可能性が高いことを明らかにした。しかし、SRKとMLPKの直接的な相互作用や、自家不和合性反応時にMLPKがリン酸化等により活性化されているといった証拠は得ることは出来なかった。
3.MLPKの標的分子の解析
酵母Two-hybrid法により、MLPKと相互作用する柱頭タンパク質を複数見出した。この内の4つの候補因子については、大腸菌を用いて組換えタンパク質を作製し、in vitroにおけるMLPK発現タンパク質との相互作用を確認した。また、in vitroリン酸化実験により、MLPKの基質となってリン酸化されることを明らかにした。今後、これら候補因子の発現部位の確認や形質転換実験を通じて、自家不和合性の情報伝達への関与を明らかにしていく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】15,500千円 (直接経費: 15,500千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09878164 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エリスロポエチン / JAK2 / STAT5 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / チロシンキナーゼ / 分化

【研究成果の概要】

我々は赤芽球様細胞ELM-1を用いてエリスロポエチン(EPO)による赤血球分化の研究を行っている。この細胞はEPOによりヘモグロビン陽性にまで成熟し、IL3はそれ自体では分化は誘導しないもののEPOによる赤血球分化を促進する。我々はEGF受容体とEPO受容体のキメラ分子を作成し、さら受容体のチロシン残基に変異を導入することで受容体細胞内ドメインの2つのチロシン残基(Y343、Y401)のいずれかが赤血球分化に必須であることを証明した。これら2つのチロシン残基はSTAT5の活性化に必要であり、STAT5と分化は密接に関連していることが考えられた。しかしながらIL3受容体やプロラクチン受容体とのキメラ作成して本細胞に導入したところ、これらのキメラ分子はSTAT5を活性化するもののこの細胞の赤血球分化は誘導しないことを明らかにした。したがってIL3受容体になくEPO受容体に特異的な分化シグナルが存在し、STAT5とともに分化の促進に働くと考えのが自然であろう。そしてそのシグナルの発生にはEPO受容体Y343、Y401のいずれかのりん酸化が必要であることが示唆される。現在この2つのリン酸化チロシン残基と会合する情報伝達分子をクローニングすべくりん酸化ペプチドによる精製と酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行っている。またJAK2の新しい基質となりうる分子APS(adaptor contatining PH and SH2 domain)をクローニングしており今後エリスロポエチンシグナルにおける役割を明らかにしたい。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09044349 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JAK / STAT / サイトカイン / SH2ドメイン / チロシンキナーゼ / トランスジェニックマウス / ノックアウトマウス / ユビキチン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

サイトカインは受容体の細胞内ドメインに会合するJAKチロシンキナーゼを介して細胞内にシグナルを伝える。STATはそのシグナルを核へ伝える重要な転写因子のひとつである。
一方サイトカインシグナルを負に調節するメカニズムやサイトカイン間のクロストークの分子レベルでの解明も進んできている。われわれはSTAT5の負のフィードバック調節因子であるCIS1,JAKキナーゼの阻害因子であるJABをクローニング、さらにこれらを含むCISファミリーの存在を明らかにした。本研究では培養細胞を用いて、CISは受容体に結合することでSTAT5を抑制し、JABおよびCIS3は直接JAKのチロシンキナーゼドメインに会合しその活性を抑制することを明らかにした。CIS3,JABのノックアウトは完成しており現在解析中である。次にJABおよびCIS3のJAKシグナル抑制の分子機構を明らかにするために欠失変異や両者で保存されているアミノ酸に様々な点変異を導入し構造活性相関を行った。その結果JAB,CIS3のSH2ドメインはJAK2のactivation loopに存在するY1007にSH2ドメインを介して結合することを発見した。しかしJAK活性化抑制にはSH2ドメインだけでは不十分で近接したアミノ酸約12個の部分が必須であり、この部分はJAB,CIS3でよく保存されている。この領域をキナーゼ阻害領域と名付けた。またこのN末端部分がないとJAKへの結合力が極端に落ちることからJAB,CIS3はSH2ドメインでactivation loopと、さらにN末端部分でJAKの活性中心に結合していると考えられる。がんで重要な働きをするチロシンキナーゼの阻害因子の分子機構が明らかにされた意義は大きい。CIS1はサイト力イン受容体に会合するがそれだけでSTAT5の活性化を抑制できるかどうか不明である。我々はフランスのグループとともにCIS1がユビキチン化されすみやかに分解を受けることを見い出した。チロシンりん酸化されたSTAT5もまたユビキチン化によって分解されることが知られており、CIS1が何らかの機構でSTAT5の分解を促進している可能性が考えられる。今後阻害の分子機構をより詳細に解明したい。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】09470036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / エリスロポエチン / 胎児造血 / エリスポエチン / エリスロポエチン受容体 / シグナル伝達 / 細胞分化 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology 2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明らかとなった。また最も高い発現はCD34 low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分面に得られた。現在生化学的な解析を行っている。
次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】08680774 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / JAK / SATA / チロシンキナーゼ / 転写因子 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達

【研究成果の概要】

酵母two-hybrid系を利用してJAK2のキナーゼドメインと直接結合しうる分子をスクリーニングした。その結果新規遺伝子JAB(JAK-binding protcin)をクローニングした。JABは構造的にCIS(cytokine-inducible SH2 protein)に類似した分子であり、293T細胞を用いた実現ではJAK1,2,3およびTyk2どのJAK分子とも会合した。two-hybrid系ではCISはJAK2とは結合しなかった。またキナーゼドメインに変異を導入してキナーゼ活性をなくしたJAK2とは結合しなかったのでJABはSH2ドメインとJAK2の自己りん酸化部位を介して結合しているものと考えられた。次に293細胞においてJAK2を過剰発現させるとJAK2の自己りん酸化や基質であるSTATのりん酸化を検出できる。このときJABを共発現させるとJAK2の自己りん酸化やSTATのりん酸化が強力に抑えられることがわかった。ルシフェラーゼアッセイにおいてJABはSTAT3,STAT5の活性化を抑制した。またJABを安定に高発現させた繊維芽細胞はインターフェロンによる細胞増殖抑制効果にたいして耐性を示した。したがってJABはひろくJAK-STAT経路の負の調節因子と考えることができる。さらにデータベースの検索によってESTとして登録されているcDNAのなかにCIS,JABと構造的に類似する遺伝子が少なくとも3つ存在することが明かとなった(CIS2,3,4)。SH2ドメインは25-35%程度のアミノ酸が同一であり、他のSH2ドメインとは明かに異なったグループをつくる。さらにこのファミリーではC末端約40アミノ酸(CIS-homology motif ; CH motif)がよく保存されており機能的に重要と考えられる。このなかには保存されたチロシン残基が存在し、この領域がキナーゼのpseudesubstrateとして作用してキナーゼ活性を抑制するというモデルを考えている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1996

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)

【研究分野】植物生理

【研究領域課題番号】06454015 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

気孔 / 青色光効果 / プロトンポンプ / 情報伝達 / リン酸化 / 脱リン酸化 / 蛋白質リン酸化酵素 / 蛋白質脱リン酸化酵素 / 光情報伝達系 / プロテインキナーゼ / プロテインフォスファターゼ / Guard cell / Stomata / Ilne light response / Ca^<2+> / H^+-ATPane / Proton pumping / adaxial epidermis / proten phompnosylatin / 孔辺細胞 / ミオシン軽鎖キナーゼ / カルシウム / 蛋白質のリン酸化

【研究成果の概要】

孔辺細胞プロトプラストを用いて青色光依存のプロトン放出に関与するプロテインキナーゼのクローニングを試みた。青色光依存のプロトン放出はミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)阻害剤で阻害されることから、この反応にMLCK様タンパク質が関与することが示唆されていた。孔辺細胞中にニワトリ砂嚢のMLCK抗体と反応するタンパク質の存在を見出したので、この抗体を用いて新たに作製した孔辺細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングすると、2個のポジティブクローンが得られた。このクローンはそれぞれ3および4キロベースのcDNAを持っていた。それぞれVFPK1,VFPK2と名付けられたcDNAの塩基配列を決定すると、互いに88%の相同領域を有していたので、まず、VFPK1について詳しく調べた。VFPK1は4個のオープンリーディングフレイムを持ち(ORF1-4)、ORF2はプロテインキナーゼに相同な領域と、キナーゼに必須なサブドメインを有しており、MLCKと約17%の相同性があった。このタンパク質を大腸菌体内に過剰発現させ、そのキナーゼ活性をミエリン塩基性タンパクを基質とするゲル内リン酸化法により測定すると、高い活性が認められた。そこで、このタンパク質を抗原として抗体を作製した。この抗体は孔辺細胞中の17および32kDのタンパク質と反応した。このうち17kDのものは孔辺細胞葉緑体中に、また、32kDのものは細胞質中に存在していた。さらに、詳しく相同性検索を行うと、このORF2はArabidopsisにおいてレトロトランスポゾンの一種として報告されている遺伝子と相同性が高かった。また、ORF4はショジョウバエで報告されているレトロトランスポゾンの逆転写酵素と41%の相同性があった。以上の結果に基づくと、得られたcDNAのコードするタンパク質はプロテインキナーゼ活性を有し、孔辺細胞中に発現し、かつMLCKとある程度の相同性を有していた。しかし、それが青色光依存のプロトン放出に関与するかどうかについては、さらに検討が必要である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1994 - 1996

【配分額】7,200千円 (直接経費: 7,200千円)