【研究領域課題番号】18K18358 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 組織工学

【研究成果の概要】

筋肉や腱を含む運動器の健康維持は、超高齢化社会の到来した我が国においてますます重要になっている。そこで、本研究では腱細胞を有する３次元骨格筋組織モデルの構築を目的とした。ヒト腱細胞とヒト筋細胞の共培養条件を検討した結果、両端に腱細胞を配置したひも状３次元筋組織において、筋細胞の自発的な筋収縮を達成した。また、共培養時の細胞の相互作用を明らかにした。本研究は、将来的に筋肉と腱の相互作用を調べるモデルの構築につながると期待される。

【研究の社会的意義】

薬剤の開発や疾患の治療法確立のためには、生体を模倣したヒト組織モデルが必要である。特に、運動器の健康増進に貢献するモデルは、超高齢化社会を迎えた我が国において価値が高いと考える。近年、３次元組織培養技術の発達により、生体に近い組織を体外で構築することが可能になっているが、機能的なヒト腱-筋モデルは未だ存在していない。本研究では、腱-筋モデル構築の端緒となる腱細胞と筋細胞の３次元的共培養に着手している点に学術・社会的意義が認められる。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2018-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】17K07132 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

精子形成 / 精原細胞 / エピジェネティクス / ヒストン / 制限幹細胞 / 精巣 / 精原幹細胞 / 発生・分化 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

ヒストン脱メチル化酵素であるFbxl11の精子形成における機能を明らかにすることを目的として、生殖細胞特異的Fbxl11ノックアウト(Fbxl11 cKO)マウスを作成し解析を行った。その結果、Fbxl11cKOマウスでは、精原細胞の自己複製には大きな影響は見られない一方で、精原細胞の分化が著しく抑制され不妊になることが明らかになった。さらに、Fbxl11 cKOマウスの精原細胞では、mTORC活性の低下が起こり分化が抑制されていることが明らかになった。以上の結果から、Fbxl11はmTORシグナルを介して精原細胞の分化を調節するという新規のモデルが提唱された。

【研究の社会的意義】

生殖細胞は次世代に遺伝情報を伝達しうる唯一の細胞系譜であり、その発生を制御する分子基盤を明らかにすることは基礎科学的に極めて興味深い分野であると同時に、不妊・不育が大きな問題となっている今日において社会的にも希求性の高い研究である。本研究では、ヒストン脱メチル化酵素Fbxl11がmTORシグナルを介して精原細胞の分化を調節することを明らかにしており、エピジェネティクス制御を介した精原細胞のホメオスタシス維持機構を理解する上で重要な知見となる。さらに、本研究の成果は新たな不妊治療技術を開発するための一助となることも期待できる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】17K07437 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トレニア / シロイヌナズナ / シュート再生 / 表皮細胞 / 脱分化 / 細胞分裂 / シュート頂分裂組織 / 不定芽 / サイトカイニン / 遺伝子発現 / 遺伝子 / 細胞・組織 / 植物 / 発生・分化

【研究成果の概要】

本研究では、茎断片の表皮細胞が脱分化・増殖し、カルス相なしに不定芽のシュート頂分裂組織（SAM）を新たに形成する、トレニアの直接シュート再生系を用い、脱分化とSAM新構築について、細胞学的解析とトランスクリプトーム解析を行った。その結果、サイトカイニンに応答した表皮細胞の核小体の発達と細胞分裂の再開、光依存の細胞増殖の活性化を経て、増殖細胞の領域化が起き、SAMが構築されることなどが明らかになった。また、シロイヌナズナの2段階シュート再生系との比較から、基本的な経路は大きく異なること、しかしそれにも関わらず共通した発現変動を示す遺伝子群が存在することなどがわかった。

【研究の社会的意義】

本研究では、トレニアの直接シュート再生系を解析し、多くの情報を蓄積したほか、シロイヌナズナの２段階シュート再生系と比較して、基本的な経路が大きく異なるにもかかわらず、同じような発現変動を示す遺伝子セットが存在することを見出した。これらの結果は、シュート再生の経路に関する新知見を提供するとともに、再生の遺伝子ネットワークに経路によるものと経路によらないものがあることを示唆している。広く細胞リプログラミングやパターン生成の共通素子を理解することにつながり、その点で大きな学術的意義がある。また、シュート再生能の制御に応用することで、植物バイオテクノロジーにも貢献できる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】17H05081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胃上皮幹細胞 / 萎縮性胃炎 / 粘膜再生 / 腸上皮化生 / 分化 / 胃癌 / アセチルコリン / 遺伝子発現解析 / 内科 / 細胞・組織 / ゲノム / マイクロアレイ / 発生・分化

【研究成果の概要】

胃の幹細胞と前駆細胞および各種成熟細胞の遺伝子発現解析によりそれぞれの選択的なマーカーを新規に同定し、またそれぞれを標識可能なマウスを作成した。幹細胞その他の細胞群が発癌の超初期の段階において、どのような病理学的・分子学的変化を生じるのかについて、マウスモデルによる詳細な時系列解析と遺伝子発現解析によりその機序を明らかにした。幹細胞の増殖や粘膜再生がTuft細胞を介したアセチルコリン-ERK経路によって制御されていることを明らかにし、さらに胃炎・胃癌の発生前段階で生じる壁細胞の消失を改善させる化合物を同定した。

【研究の社会的意義】

新規の胃上皮幹細胞マーカーの同定とその制御機構を解明したことにより、胃発癌や粘膜再生のメカニズムを明らかにすることに貢献した。
胃癌や腸上皮化生は成熟細胞ではなく幹細胞・前駆細胞から発生することが明らかになり、より選択的な治療標的の同定や、発癌予測のバイオマーカーの樹立に役立つ可能性がある。
Tuft細胞や壁細胞の分化制御機構やその粘膜再生における機能を明らかにしたことで、今後の胃癌に対する予防や治療の開発に結びつく可能性がある。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】25,480千円 (直接経費: 19,600千円、間接経費: 5,880千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】17K08621 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

γセクレターゼ / Notchシグナル / 初期ゴルジ / Rer1 / 細胞膜タンパク質 / タンパク質品質管理 / 神経幹細胞 / 大脳形成 / 神経難病 / 大脳発生 / ゴルジ体 / γ-secretase / リソソーム / 膜タンパク質 / 脳神経疾患 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 蛋白質

【研究成果の概要】

Rer1はゴルジ体に存在し、異常なタンパク質や組み立てに失敗したタンパク質を小胞体に送り返す役割をしていることが分かっています。本研究では、Rer1が欠損するとγ-セクレターゼ複合体やその構成因子の一部がリソソームへと輸送され分解されることを示しました。Rer1をマウスの脳形成時に欠損させると、脳内のγ-セクレターゼ量が減少することにより神経幹細胞の増殖や維持に働くNotchシグナルが低下し、神経幹細胞の量の減少を伴う大脳の形成異常や様々な行動異常が認められました。以上の結果から、Rer1によるγ-セクレターゼの品質管理が正常な脳の発達や高次脳機能に重要な役割を果たしていると考えられました。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】16H04798 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大脳皮質 / 初期ニューロン / 細胞分化 / 進化 / 大脳新皮質 / カハールレチウス細胞 / サブプレート細胞 / 遺伝子発現 / カハール・レチウス細胞 / サブプレート / 幹細胞 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 神経科学

【研究成果の概要】

哺乳類以降で急速に発達し、ヒトにおいて最も数が増大した大脳皮質で最初に誕生するニューロン群は、その発現分子も含め、これまで知見が極めて乏しかった。本研究では大脳皮質初期ニューロンの分子多様性の意義を明らかにすることで、哺乳類特有の大脳皮質の形成機構を解明することを目的とした。特にゲノムワイドアプローチによる初期ニューロンに特異的に発現する新規遺伝子群の同定、異種間遺伝子導入・細胞移植により、大脳皮質初期ニューロンに発現する遺伝子の多様性が、哺乳類特有の大脳皮質構造の形成に重要な役割をもつことが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】11,960千円 (直接経費: 9,200千円、間接経費: 2,760千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】16H04787 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞骨格 / 細胞周期 / 細胞分裂 / 微小管 / 細胞・組織 / 遺伝子 / 遺伝学 / 発生・分化 / 細胞生物学 / 分子生物学

【研究成果の概要】

本研究では、微小管が細胞のなかでどのように形成されるのか、分子レベル・細胞レベル・組織レベルの各階層にわたり解明することを目指している。これまでに、分裂酵母・ヒト培養細胞を用いて微小管形成機構を調べており、さらにマウス組織での実験をおこなうための飼育・実験の基盤作りをおこなった。その結果、Alp7/TACCが微小管形成においてガンマ・チューブリン複合体と協調して微小管の形成を促進すること、さらにAlp7が存在しない細胞でも微小管を形成するシステムの存在が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】16H05405 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

オルガノイド / 移植 / 門脈 / 他臓器移行 / 門脈内移植 / 3次元培養 / ヒトiPS細胞 / 中型動物 / 体内動態 / スフェロイド / 再生医学 / 移植・再生医療 / 細胞・組織 / 動物 / 発生・分化 / ブタ / iPS細胞

【研究成果の概要】

肝臓領域を中心としたオルガノイド研究が盛んに行われており、移植による新規治療法開発が期待されている。これまで肝細胞を経門脈的に移植する臨床試験が世界各国で報告されているが、オルガノイドを経門脈的に移植した報告は見られない。そこで今回ブタを用いて経門脈的に胎仔肝細胞由来肝オルガノイドおよびヒトiPS細胞由来肝オルガノイドの移植を行い、安全性検討を行った。移植による門脈圧上昇は一過性で全頭安全に移植を施行できた。肺、脳等の他臓器には組織移行は見られなかった。肝オルガノイドの経門脈移植は安全に施行可能であり、今後臨床試験を目指した開発を行っていく。

【研究の社会的意義】

肝オルガノイドの経門脈移植の安全性を確立することはiPS 細胞治療のみならず、今後の幹細胞を用いた再生医療にとって必要な基礎的データとなる。幹細胞移植による他臓器への細胞の迷入は大きな課題であり、肝芽移植によって迷入がなくなることが本研究で実証でき、再生医療の安全性の確保に繋がると考えられる。本研究成果は肝臓のみならず、他の臓器への経血管的なオルガノイド移植の安全性を示唆すると考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】動物生理・行動

【研究領域課題番号】26440184 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞・組織 / シグナル伝達 / 生体分子 / 生理学 / 発生・分化 / 非神経性アセチルコリン / オルガノイド / 腸幹細胞 / コリン作動系 / 腸上皮 / 腸オルガノイド / ニコチン性アセチルコリン受容体 / 腸上皮幹細胞

【研究成果の概要】

研究代表者は腸オルガノイド培養系を用いて、腸上皮細胞内ACh産生系が存在すること、及び腸上皮にある内因性AChが代謝型ムスカリン性ACh受容体（mAChRs）を介して腸幹細胞の分化・増殖、維持機構に関与することを突き止めた。さらに、「多段階質量分析イメージング」（MS/MS測定）を応用することにより、ごく微量のAChを腸組織切片から直接検出し、腸上皮組織にAChが分布していることを初めて可視化することに成功した。本研究により、非神経性AChが細胞分化、組織形成に関与しているという今までほとんど研究のターゲットにされなかったAChの新規生理学的役割をin vitroで明らかにすることに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】26253069 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

食道胃接合部 / ES細胞 / 内胚葉上皮 / 組織形成 / オルガノイド / 内胚葉 / 食道 / 胃 / 前腸形成 / 臓器形成 / 食道・胃接合部 / 発生学 / 分化誘導 / 発生・分化 / 再生医学 / 癌 / ゲノム / 細胞・組織

【研究成果の概要】

本研究では、発生過程における食道―胃接合部形成機構の解明を目指した。遺伝子ノックアウト及びlineage tracing実験、複数の転写因子の発現を示す蛍光蛋白レポーターマウス (”Rainbow Mouse”)の作成と同マウスから採取した細胞のin vitro分化誘導実験の結果、発生13.5日までに接合部形成位置を境として逆方向のSox2/GATA4の濃度勾配が形成され、結果的に胃側間質にFGF10、食道側上皮にFGFR２が誘導される結果、限局したERK活性化を引き起こすことで、接合部が未分化状態の上皮として成体まで維持されることがわかった。

【研究の社会的意義】

食道―胃接合部や十二指腸Vater乳頭部、直腸歯状線、子宮頸部などの“異なる上皮の接点”は人体の複数の場所に存在し、腫瘍の発生母地になり得るという臨床上の共通した特性がある。
本研究では、これまで未解明であった発生期食道―胃接合部の形成機構／維持機構を明らかにした。まず、接合部形成位置を挟んでそれぞれの細胞運命を規定する転写因子が逆方向の濃度勾配を形成し、上皮―間質相互作用で一方の間質シグナルを誘導し、他方の上皮でその受容体を発現するという巧みな方法で、接合部に限局したシグナル活性化を来すことがわかった。他の“異なる上皮の接点”形成機構にも共通する可能性があり、今後の解明が待たれる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2019-03-31

【配分額】40,560千円 (直接経費: 31,200千円、間接経費: 9,360千円)

【研究分野】統合動物科学

【研究領域課題番号】25292185 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨格筋 / 脂肪細胞 / 線維芽細胞 / 間葉系前駆細胞 / CSPG4 / ジストロフィン / 筋分化 / 脂肪分化 / 筋ジストロフィー / サルコペニア / 再生医学 / 筋細胞 / 細胞・組織 / 生理学 / 畜産学 / 発生・分化

【研究成果の概要】

加齢による筋萎縮（骨格筋減弱症）や筋再生が正常に進行しない筋ジストロフィーなどの筋疾患では、骨格筋内に通常みられない脂肪細胞が出現する。この脂肪細胞は生体恒常性の維持を担う骨格筋機能に大きな影響を与えることから、本研究ではその出現機序や病態生理学的意義を明らかにすることを目指した。その結果、骨格筋内脂肪細胞の起源とされる間葉系前駆細胞の分化制御を担う新規分子としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン4を同定することができた。また、ヒトの病態を極めて忠実に再現し、骨格筋内に脂肪蓄積を生じる新規筋ジストロフィーモデルラットの開発に成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】19,500千円 (直接経費: 15,000千円、間接経費: 4,500千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】25713059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血管 / 創傷治癒 / VEGF / VEGFR2 / 発現制御 / 発生・分化 / 循環器・高血圧 / 血管新生 / 細胞・組織 / 臨床

【研究成果の概要】

皮膚・軟部組織が損傷・欠損すると、これを復元すべく内因性の創傷治癒機構が発動する。その過程において中心的な役割を果たすのが周囲の血管からのいわゆる「血管新生」であると考えられている。本研究では、この創傷治癒における血管の変動を、従来の「血管新生」の枠組みにとどまらず、より包括的に「創傷血管網リモデリング」と称し、その全容の解明を目的として遂行された。その結果、創傷血管網リモデリングの主体は、血管の増殖や分枝増加よりむしろ、血管径の増大や血流増加、創収縮に伴う血管の方向性の変化であり、特に前2者については、各種変異マウスの解析により、VEGF/VEGFR2シグナルに依存していることをつきとめた。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】25,220千円 (直接経費: 19,400千円、間接経費: 5,820千円)

【研究分野】脳神経外科学

【研究領域課題番号】24592181 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

glioma stem cell / survival / proliferation / undifferentiated state / niche / 癌 / 細胞・組織 / 脳神経疾患 / 発生・分化 / 薬剤反応性

【研究成果の概要】

ヒトグリオーマ幹細胞（GSC）の生存・増殖・未分化性維持に関わるニッチ解明を目指し、GSC樹立、細胞特性および分子遺伝学的特性解析を実施した。56検体の腫瘍組織から長期培養可能腫瘍細胞凝集塊（LC-TS）を11株樹立成功した。腫瘍組織型（grade4、再発・2次性腫瘍）、遺伝学的特性（野生型IDH1/2、TP53、TERTプロモーター変異、MGMTプロモーター低メチル化、抗原X陽性）とLC-TS樹立効率との関連性を明らかにし、in vivo腫瘍形成能が異なるLC-TSが存在し、複数の遺伝子発現差異が関与することを明らかにした。これらはGSCの特性解明に通じる成果であると結論づけられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】22790653 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES細胞 / 膵臓 / β細胞 / インスリン / 糖尿病 / 低分子化合物 / スクリーニング / 発生・分化 / 再生医学 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

マウスES細胞から膵β細胞を誘導する手法の効率化は将来的にヒトの糖尿病治療に有効な知見を得るために重要な研究である。我々は、1300種の低分子化合物からβ細胞の誘導効率を上昇させる化合物をスクリーニングした。その結果、10個のヒット化合物を発見し、これらの作用から特定の生体内の経路がβ細胞への細胞分化とインスリンの分泌能に深くかかわることを見出した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】22591835 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

移植・再生医療 / 細胞・組織 / 発生・分化

【研究成果の概要】

マウス卵形成による遺伝子発現変化を、7日齢マウスからの未熟卵子、およびこれを体外成熟させたMII卵子、そして成熟マウスから得た体内成熟MII卵子各5個由来の遺伝子をサンプルとして、RiboSPIA法による増幅後のマイクロアレイ解析を行い、各群が独立した3つのグループにわかれることがあきらかになった。さらにこの結果をRiboSPIA法による増幅産物を用い、次世代シークエンサーで確認した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】21790671 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヒトiPS細胞 / ES細胞 / モデル細胞 / 発生分化 / 再生医学 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

これまでに、我々はマウス中腎由来培養細胞株M15細胞との共培養系を用いて、ES細胞から消化器官(膵臓、肝臓)細胞の分化誘導方法を開発し、分化に関わる因子を明らかにした。今回の研究では、M15細胞を用いてマウスES細胞から内胚葉細胞を効率的に分化させた後に小腸分化を促進する液性因子を添加することで、小腸前駆細胞を効率よく分化誘導することにも成功した。更に、M15細胞上で分化を進めることで、すべての小腸細胞が分化誘導可能であることも確認している。本方法は、マウスES細胞のみならずヒトiPS細胞にも応用可能であることも併せて確認した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】21689047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

創傷治癒 / 血管 / マクロファージ / 形態学 / 血管新生 / CSF1 / 細胞・組織 / 循環器・高血圧 / 発現制御 / 臨床 / 発生・分化 / 細胞・組

【研究成果の概要】

血管の密度、つまり血管の「量」そのものは組織への酸素運搬能という血管本来の機能、即ち血管の「質」と相関しないことがわかりつつある。本研究は皮膚創傷組織において、この血管の「質」を規定する分子メカニズムを明らかにするために行われた。申請者は創傷組織のホールマウント血管染色技術を新たに確立し、そのダイナミクスの観察を可能にした。これにより血管増生よりむしろ血管の拡張が、その「質」を規定する主要な因子であることを見出した。また、種々の遺伝子改変マウスの解析により、貪食細胞の一つとして知られるマクロファージが血管の拡張、ひいては血流の増大に密接に関与することを見出した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2009 - 2012

【配分額】27,560千円 (直接経費: 21,200千円、間接経費: 6,360千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】20689028 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨・軟骨代謝学 / 再生医学 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 軟骨細胞 / 軟骨内骨化 / 変形性関節症 / 転写因子 / HIF2A

【研究成果の概要】

変形性関節症(OA)の発症には軟骨細胞の肥大分化以降の軟骨内骨化過程が関与する。OA治療標的分子の同定を目指して、まず肥大分化マーカーCOL10A1のpromoterを用いて上流分子のスクリーニングを行ったところ、hypoxia-inducible factor 2α(HIF2A)が最も強い転写活性を示した。HIF2Aへテロ欠損(+/-)マウスは軟骨細胞の肥大分化と骨化の障害による成長遅延を呈した。HIF2Aはマウス実験モデルとヒト手術摘出膝関節軟骨においてOAの進行に伴って発現が亢進しており、+/-マウスでは関節軟骨破壊が抑制された。また培養軟骨細胞にHIF2Aを過剰発現および発現抑制したところ、COL10A1,MMP3,9,13,VEGF,IHH,PTH1R,RUNX2などの軟骨内骨化マーカーの発現が、それぞれ増加および減少した。これらの発現は+/-マウスの軟骨では低下しており、luciferase assay、EMSA、ChIPによりHIF2Aがこれらの分子のpromoterの各応答配列に結合して直接転写を誘導することが示された。続いてHIF2A promoterを用いたスクリーニングでは、NF-κB family分子RELAがNF-κB motifを介して強力にHIF2Aを転写誘導した。RELAはOA関節軟骨でHIF2Aと共に発現が上昇し、培養軟骨細胞でIL-1、TNF-αがHIF2Aを誘導することから、NF-κBがHIF2Aの上流シグナルであることが示された。さらにROADスタディ住民コホートのゲノム関連解析(397 OA vs.437対照)においてHIF2A遺伝子5'UTRのSNP(+18C/T)が有意な疾患感受性(p=0.013;OR=1.44)を示し、培養軟骨細胞では疾患allele(+18C)promoterが対照(+18T)より有意に高い転写活性を示した。この活性の差は上記のNF-κB motif内の変異導入によって見られなくなったため、本SNPはNF-κBによるHIF2A誘導を介してOAに関与していることが示された。以上より、マウスのみならずヒトでもHIF2A/NF-κBシグナルは複数の軟骨内骨化関連分子を転写誘導することでOAを制御しており、強力な治療標的の候補であることが明らかとなった。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】22,750千円 (直接経費: 17,500千円、間接経費: 5,250千円)

【研究分野】呼吸器内科学

【研究領域課題番号】20790580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / シグナル伝達 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 発現制御 / 発生・文化

【研究成果の概要】

EGF刺激によりTGF-βの細胞内シグナル伝達分子Smadファミリーのリンカー領域のリン酸化が誘導される。Smad結合タンパクPin1がこのリンカーリン酸化特異的にSmadに結合することを見出し、それがSmadのSmurf2ユビキチンリガーゼによるユビキチン化と分解を誘導し、TGF-βシグナルを抑制することを明らかにした。これにより線維化における重要なサイトカインであるTGF-βシグナルが癌細胞での様々なEGFシグナル異常により制御を受ける一つのメカニズムが示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】解剖学一般(含組織学・発生学)

【研究領域課題番号】20590196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞・組織 / 再生医学 / 脳・神経 / 発生・分化 / 神経科学 / 中枢神経系 / 幹細胞 / 遺伝子 / 細胞死

【研究成果の概要】

我々が既に単離同定している神経幹細胞に発現する新規遺伝子群のなかかのひとつSE90/radmis遺伝子について解析を進めた。in situ hybridization解析により、radmis mRNA発現は胎生期の脳室周囲層、および生後や成体脳の側脳室の脳室下層といった神経幹細胞が局在すると考えられる部位での発現が認められた。また特異的抗体による組織学的解析の結果、radmisタンパクは神経幹細胞の放射状細胞突起と分裂期紡錘体微小管に一過性に局在し、分裂後は速やかに後期促進複合体APC/Cdh1によるユビキチン化を受けてタンパクが分解され、幹細胞内から除去される可能性が示された。実際の個体レベルでの神経発生過程でのradmis遺伝子の機能を検討するため、ユビキチン化を受けないよう改変した変異型radmis遺伝子を作製し、子宮内電気穿孔法によりマウス胎児の脳室内へ遺伝子導入を行った。その結果、radmis遺伝子を強制発現した神経幹細胞では分裂の亢進と細胞移動の異常が起きる事が明らかとなった。以上のデータからradmisが神経幹細胞の分裂制御に重要な働きを持つことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】18770169 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 骨疾患 / 破骨細胞 / サイトカインレセプター

【研究成果の概要】

骨吸収を担う破骨細胞の分化・活性化は、受容体RANK及びそれに結合するアダプター分子TRAF6によって制御されるが、RANK/TRAF6シグナルの分子機構には不明な点が多い。申請者は、昨年度の本研究課題において、TRAF6シグナルの増強を担い、破骨細胞分化誘導に必須であるRANK細胞質領域を発見した。本年度は、この領域の欠損RANK変異体を用いた解析及びこの領域への結合因子の同定を行うことにより、RANKによるTRAF6シグナル増強機構の解明を試み、以下の成果を得た。
RANKのTRAF6シグナル増強領域を欠損させると、刺激初期における転写因子NFκBの活性化には影響がみられないが、野生型RANKで観察される長期にわたるNFκB活性化が消失した。さらに、野生型RANK及び欠損変異体の細胞内での局在を解析したところ、野生型RANKでは刺激後、細胞膜上から細胞内に取り込まれエンドソームに局在するのに対して、欠損変異体ではエンドソームに移行せず細胞膜上に局在したままであった。一方、TRAF6シグナル増強領域に結合する因子を、既知の破骨細胞形成制御因子の中から免疫沈降法により探索したところ、幾つかの結合因子を同定することができた。これらの結果から、RANKのシグナル増強領域は幾つかの結合因子を介してRANKのインターナリゼイションを促進させることで、TRAF6シグナルの増強を担っている可能性が示唆された。このことは、受容体の局在の変化がシグナルめ質を決定することを示しており、破骨細胞形成の分子機構の解明に新たな知見を与えるだけでなく、骨疾患治療における新しい分子標的の候補の発見に繋がると考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】18390150 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

免疫学 / シグナル伝達 / 発現制御 / 発生・分化 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

免疫システムにおける自己-非自己識別機構の人為的な制御は自己免疫疾患の治療、移植免疫寛容誘導、癌免疫誘導など様々な臨床的応用に期待できる。申請者は、胸腺髄質上皮細胞の分化とそれによる自己免疫寛容誘導の分子メカニズムを解明し、自己免疫疾患治療や癌免疫誘導の新規方法論を創造することを目指している。申請者は既にTRAF6が胸腺ストローマ依存的な自己免疫寛容の誘導に必須であることを証明した。本研究課題では胸腺ストローマにおけるTRAF6依存性シグナルの標的分子および上流のレセプターとリガンドを同定し、それら分子の自己免疫寛容への関与を検証することを目的とした。
胸腺ストローマにおけるTNFレセプターファミリーの発現を半定量的RT-PCRで網羅的に解析し、TRAF6の上流レセプター候補としてRANKとCD40を得た。各レセプター単独の欠損ではTRAF6欠損マウスの表現型より緩和であるため、TRAF6の上流レセプターとしては不十分であった。しかし両者を欠損するマウスを作製し、解析することでRANKとCD40の両者が協調的に機能することで胸腺髄質上皮細胞を分化させ、その結果自己免疫寛容を誘導すると結論した。さらにRANKやCD40のリガンドは未熟な髄質上皮細胞を含む胸腺ストローマin vitroで分化誘導に十分であった。この実験系を用いて、RANKとCD40の下流にTRAF6やNIKが存在することを証明し、当初の目的であった「胸腺髄質上皮細胞の分化を誘導するTRAF6の上流レセプターの同定」を完遂した。さらにマイクロアレイ法によりTRAF6シグナルの標的遺伝子を決定した。これらは、胸腺依存的な自己免疫寛容の誘導機構の理解において重要な結果であると考える。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】16,490千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 1,590千円)

【研究分野】呼吸器内科学

【研究領域課題番号】18790555 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / シグナル伝達 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 発現制御

【研究成果の概要】

転移性肺癌モデルにおけるE3リガーゼノックダウン効果の検証:作成したmiRNA発現レンチウイルスベクターを用いて、MDA-MB231細胞株でE3リガーゼSmurf2及びSmurf1の安定的なノックダウンをウェスタンブロッティングで確認した。これらのE3リガーゼは受容体をユビキチン化・分解してTGF-βシグナルを抑制することが報告されているが、ノックダウンが同細胞で実際にシグナルに影響するか否かを標的遺伝子発現やシグナル伝達分子Smadのリン酸化レベルで確認した。その結果一方のE3リガーゼのノックダウンによって予想外に他のE3リガーゼの蛋白量が増加すること、シグナルへの影響が一方で認められないことが明らかとなった。この点について更なる解析を行い一方のE3リガーゼが別のE3リガーゼをユビキチン化・分解していることを初めて見出し発表した。
肺癌モデルにおけるE3リガーゼの効果の検証:前年度の肺腫瘍細胞での検討に加えてマウス肺組織でのArkadiaをはじめとしたE3リガーゼの発現をRT-PCRで確認した。合わせて既に同定していたArkadia結合蛋白RB1CC1が同様に肺組織で発現していたことに注目し、ArkadiaのTGF-βシグナル増強作用へのRB1CC1の役割を解析し報告した。またArkadiaの新たな基質としてがん遺伝子c-Ski/SnoNを同定し報告した。今後肺癌モデルでのこれらの知見を踏まえた上でのさらなる検討を計画している。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】眼科学

【研究領域課題番号】18591930 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

移植・再生医療 / 細胞・組織 / 生体分子 / 発現制御 / 発生・分化

【研究成果の概要】

SJS等の角膜上皮幹細胞疲弊症に対する眼表面再建術の際に摘出した組織から新鮮凍結組織切片を作成し、免疫組織学的にTNC分子の発現を検討した結果、TNCタンパクが結膜下に多量に沈着していることが判明した。TNC遺伝子のプロモーター解析のために、レポーターコンストラクトを作成して、角膜上皮を用いて遺伝子発現を検討したところ、創傷作成、機械的ストレスでTNC遺伝子の誘導がかかることが判明した。TNCはFNコートの培養に加えた場合、細胞の形態に変化を生じる(Focal adhesion kinaseの発現の低下)が、細胞増殖能には変化がないことが、判明した。また、角膜上皮テネイシンノックアウトマウスの角膜上皮、コンジェニックマウスの角膜上皮から初代培養細胞を作成し、羊膜上に培養することで、形態学的な差異およびβカテニンタンパクの発現を免疫組織染色で検討したところ、テネイシンノックアウトマウスから作成した上皮細胞にはβカテニンの局在に極性が見られなかったのに対し、コンジェニックなワイルドタイプマウスでは上皮下にTNCタンパクの沈着が見られるとともにβカテニンが基底膜側に偏在して発現がみられ、細胞極性の形成に貢献していることが示唆された。以上の結果から、角膜上皮に強いストレスがかかった際のレスキュー分子としてTNCが発現し、TNC分子自体は上皮細胞の極性形成を通じて、上皮細胞の恒常性維持に貢献していると考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】4,010千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】17591757 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

卵子 / 胚 / ヒストン / H1foo / 移植・再生医療 / 医療・福祉 / 細胞・組織 / 蛋白質 / 発生・分化

【研究成果の概要】

卵子特異的ピストンH1(H1foo)は原始卵胞から2-4細胞期胚までにしか存在しないため、卵子の全能性や遺伝子のリプログラミングへの関与が推測されている。我々は2003年にヒト卵子特異的ピストン遺伝子を決定した。平成17年度は、卵巣内、および受精過程に於けるタンパク動態を検討した。推定アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原として作成した家兎血清を用いた免疫組織化学染色では、卵巣内でH1fooは原始卵胞からグラーフ卵胞までの卵子のみに局在し、顆粒膜細胞や間質には局在は認められなかった。また、体外受精で受精しなかった卵子34個の精子核におけるH1fooの存在と、精子核膨化の関係を検討したところ、34個中15個が膨化もH1fooの反応とも見られず、精子核膨化をみた16個すべてにH1fooの反応がみられた。残り3個では膨化が見られなかったにもかかわらずH1fooの反応が見られ、本タンパクが受精のごく初期から精子核内に取り込まれることが明らかになった。さらに平成18年度は、胚発生に伴うmRNA量の推移、体細胞ピストンへの移行、および完全長cDNAクローンの作成と、これを用いた完全長タンパク発現を試みた。結果として、ヒトに於けるH1fooはnested-PCRによる半定量法で、4細胞で胚あたり3000-6000コピー程度存在するが、桑実胚期にいたると1000-2000コピーと減少していた。一方卵子・胚には体細胞ピストンH1aが発現することが明らかになった。また、市販ヒト卵巣組織cDNAライブラリから完全長cDNAクローンを作成し、タンパク発現を大腸菌、およびコムギ胚芽無細胞系で試みた。大腸菌では発現が見られなかったが、コムギ無細胞系ではタンパク発現がみられた。現在、精製タンパクからモノクロナール抗体を作成するとともに、組み替えタンパクを作成し、リン酸化部位を解析中である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)