【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】24370069 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アクチン / ミオシン / メカノセンシティビティ / メカノセンサー / 構造多型性 / 細胞運動 / 細胞極性 / MDシミュレーション / 蛍光プローブ

【研究成果の概要】

真核細胞においてさまざまな重要現象に中心的に関与するアクチンフィラメントの機能分化機構を解明するため、アクチンフィラメントに張力が負荷されるとミオシンIIの結合が促進されるという仮説の検証を試みた。その結果、アメーバ細胞内のフィラメントに負荷される張力を見積もることができた。そうした張力をin vitroでフィラメントに負荷しミオシンIIの結合量の変化を見る実験に関しては、概ね実験系を確立でき、今後の測定への展望が開けた。蛍光エネルギー移動法による観察も最終的な結論を得るに至っていないが、細胞内のフィラメントに構造多型性があることが確認できた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】24570218 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ダイナミン / 細胞質分裂 / アクチン / ミオシン / 細胞性粘菌

【研究成果の概要】

ダイナミンは,細胞膜動態に関与する重要なタンパク質である。近年,ダイナミンは細胞質分裂にも関与することが示されてきており,その阻害剤は,細胞質分裂を標的とした新しいクラスの抗癌剤として注目されている。本研究では, 細胞質分裂におけるダイナミンの役割を明らかにすることを目的にした。ダイナミン遺伝子を欠損する細胞では細胞質分裂が異常になり，ミオシンIIやアクチンが分裂面に正常に集合できなかった。また，これらのダイナミンは分裂面に集まった。さらにダイナミンが収縮環のアクチンの安定化に関与することが分かった。以上から，ダイナミンが細胞質分裂に関与する新たな分子機構を提案した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】22247031 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分裂 / 細胞質分裂 / 収縮環 / アクチン / ミオシン / 細胞 / タンパク質 / 微細構造 / 生体分子 / シグナル伝達 / 電子顕微鏡 / 細胞周期 / 細胞運動

【研究成果の概要】

細胞質分裂は収縮環の収縮によって細胞が中央部からくびり切れることによりおこる。私は分裂酵母の収縮環ー細胞膜複合体（細胞ゴースト）を単離し、ATPを加えて収縮環を人為的に収縮させることに初めて成功した。この実験系を用い、アクチンの脱重合は収縮そのものには必須ではないことなどいくつかの性質を明らかにできた。また収縮環形成の際のアクチンの分裂位置への集合にはミオシンVが関与していることが示唆された。ウニ卵の分裂溝にアクチン重合を促進するuDiaがアクチンと共存することも示した。さらにカエル卵抽出液を人工脂質膜に封入することにより、脂質膜小胞中でアクチンの流れが起こることを見いだした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010-04-01 - 2015-03-31

【配分額】39,910千円 (直接経費: 30,700千円、間接経費: 9,210千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】21570199 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞質分裂 / アクチン / ミオシン / 細胞分裂 / 細胞性粘菌 / メカノセンシング

【研究成果の概要】

細胞は自分の形をモニターしており、変形し過ぎた場合にはそれを戻すようなフィードバック機構があるに相違ない。このような機構が細胞の形態を維持し、細胞質を等分に分割することを補償するシステムではないかと考え、本研究ではこの分子機構を解明することを目的として行なった。メカノセンサーとしてアクチン繊維が機能していること, PTEN,ミオシンが関与することが分かった。これらの異常は最終的に細胞質異常を引き起こす結果となった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】21370061 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アクチンフィラメント / ミオシン / コフィリン / 協同的結合 / 張力 / メカノセンサー / 細胞極性 / アクチン / アクチン結合タンパク質 / 協同的構造変化 / GFP

【研究成果の概要】

われわれは、アクチンフィラメントが様々な異なった原子構造をとることにより異なったアクチン結合タンパク質と相互作用し、異なった機能を果たすことができるという仮説の検証を試みた。その結果、張力によりらせんピッチが伸びたアクチンフィラメントはミオシンIIと相互作用しやすいこと、および、ミオシンIIとコフィリンという異なるアクチン結合タンパク質をアクチンフィラメントと共存させると、結合部位が競合しないにもかかわらず、両者はそれぞれ相互排他的にアクチンフィラメントと結合することを見出した。これらはいずれも上記仮説を支持する結果である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】18370067 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アクチン / ミオシン / 協同的構造変化 / 優性変異 / 優性阻害 / 組換えタンパク質 / 細胞性粘菌 / 酵母 / 一分子力学測定 / カルシウム制御 / グリシンスキャニング / 発現系 / 構造変化 / グリシン / ショウジョウバエ / 生物物理 / 分子モーター / 蛋白質

【研究成果の概要】

アクチンミオシン系の力発生において、アクチンフィラメントは線路として機能する一方、その協同的構造変化も何らかの重要な機能を果たすと考えられている。一般に協同的構造変化の機能の解明には、優性変異の解析が有力な研究手段となる。そこでAn and Mogami (1996) が同定した10 個の優性変異アクチンについて、われわれ独自のアクチン発現系を用いて6変異の精製に成功し機能解析を行った。その結果、4変異は重合に、2変異はCa2+依存的な協同的スイッチ機構に異常があることを発見した。さらにグリシンスキャニング法(後述)により、新たに5個の優性変異アクチンを同定した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】14,180千円 (直接経費: 11,300千円、間接経費: 2,880千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】15380057 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

キチン合成酵素 / Aspergillus / ミオシン / 隔壁 / アクチン

【研究成果の概要】

我々のグループではこれまでに糸状菌Aspergillus nidulansより5種のキチン合成酵素遺伝子(chsA-D、csmA)を単離しその機能解析を行ってきた。本プロジェクトではこのうち4種のキチン合成酵素ChsA-C、CsmAにそれぞれタグをつけたものについて細胞内の局在部位の検討を行った。その結果、ChsAは形成中の隔壁、それ以外のものは形成中の隔壁と菌糸先端に主に存在した。このうちこれまでの研究から機能が重複していると考えられたChsAとChsCについて共局在を検討したところ、一部局在が重なるものの、完全には一致しないことが明らかとなった。またウェスタン解析の結果から、これらのタンパク質は少なくとも一部細胞内で修飾を受けた形で存在することが示唆された。ChsBについても細胞内で修飾を受けていることが示されたが、その一部はリン酸化であることも明らかになった。一方、遺伝学的解析によりchsA chsCの二重変異株の生育にはcsmAが重要であることも示された。
CsmAはキチン合成酵素ドメインのN末端側にミオシン様タンパク質をコードするドメイン(MMD)が存在する。CsmAの細胞内での存在部位はアクチンの集中する部位と近接していたためMMDの種々の改変体を作製しその影響を見たところアクチンとの結合能を持たない改変型MMDをもつCsmAはその局在も異常になり、その機能も失っていた。さらにA.nidulansのゲノム配列が公開され、csmAのパラログがA.nidulansのゲノム上にもう一つ存在することが明らかとなった。我々はこの遺伝子をcsmBと命名し機能解析を行った結果、csmBの破壊株は菌糸の途中が膨らむバルーンの形成、菌糸内菌糸の形成などcsmA破壊株と類似の表現型も示したが一部異なる表現型も示した。またcsmAとcsmBの変異は合成致死を示すこと、CsmAとCsmBの局在部位は完全には重ならないことが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,600千円 (直接経費: 15,600千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15570133 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミオシン / モーター / 車軸藻 / 原形質流動 / ATP分解活性 / in vitro motility / アクチン / in vitro motility assay / 分子モーター

【研究成果の概要】

車軸藻ミオシンは、他のモーター蛋白質と比べて、10〜100倍の運動速度をもつ世界最速のモーター蛋白質である。車軸藻ミオシンは,その運動速度の大きさから,非常にユニークな蛋白質と言え,モーター蛋白質の動作原理を解明する上で,多くの知見が得られると期待されている。しかし,今までの車軸藻から生化学的に精製する方法で得られるミオシンは収量が少なく,純度もあまりよくなかったので,その酵素化学的性質を調べるのは困難であった。そこで,申請者は,分子生物学的手法を用いた蛋白質発現系により,速い運動速度をもつ車軸藻ミオシンの作成を試みた。車軸藻ミオシンは軽鎖が未同定なので,軽鎖を他のものでだいたいする方法を行った。その結果,車軸藻ミオシンはモータータンパク質の中でこれまで最大のATP分解活性を持つとされていた筋肉のミオシンの20倍もの活性を持つことがわかった。つまり車軸藻ミオシンの速い運動活性の一因は高いATP分解活性にあることがわかった(K.Ito et al. BBRC2003)。現在は,この発現系によって得られた車軸藻ミオシンを用いて,ストップドフロー装置により,ATP結合速度,ADP解離速度,アクチン解離速度等の詳細な酵素速度論的測定を行い速い運動速度の酵素学的基盤を明らかにしつつある。今までのところ,車軸藻ミオシンはアクチンとの結合時間を短くすることによってアクチン滑り速度を大きくしていることがわかった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】12490008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞質分裂 / 収縮環 / アクチン / ミオシン / 低分子量Gタンパク質 / アクチン調節タンパク質 / リン酸化 / 分裂溝

【研究成果の概要】

収縮環の形成機構を分裂酵母とアフリカツメガエル卵を用いて解析した。分裂酵母においては収縮環は、核分裂の間に細胞中央部に蓄積してくるF-アクチンケーブルから形成されるように見える。まず前期にF-アクチンケーブルでできたaster様構造がspindle pole body近辺に形成され、これから1本の先導ケーブルが伸びて細胞を取り巻く。蓄積したF-アクチンケーブルは先導ケーブルに融合して収縮環が完成するように見える。Cdc12は先導ケーブルの伸長に働き、Cdc15は先導ケーブルへのF-アクチンケーブルの融合過程に働くことが分かった。
低分子量Gタンパク質Rhoは細胞分裂シグナル伝達系の主要メンバーと考えている。そこでRhoシグナル伝達系がどのようにして細胞質分裂を制御するのかを解明するため、分裂酵母のRhoの研究を進めた結果、新規のRhoファミリータンパク質Rho3を見い出した。Rho3は細胞膜に局在していた。Rho3とCdc42の下流に共通の標的として新規のformin/diaphanousタンパク質のFor3があることも明らかになった。Rho3とFor3はアクチン細胞骨格、微小管を支配し、その結果、細胞形状や細胞分裂位置の決定に関与していることが分かった。
アフリカツメガエルの収縮環形成について微小管の働きを研究した。微小管毒による微小管の破壊は収縮環の収縮は阻害しないが、形成を阻害した。分裂溝直下で両極から伸びた星状体微小管が連結していることを見い出した。またこれまで細胞質分裂の分裂シグナルに関連していると思われていたCaイオンについて分裂溝付近での放出を検討した結果、分裂後半あるいは分裂後にCa waveの発生はあるものの、分裂溝先導端ではCa blip, Ca puffといった微小なシグナルでさえ存在しないことが分かった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】13,900千円 (直接経費: 13,900千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09898014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞質分裂 / 収縮環 / アクチン / ミオシン / 分裂シグナル / リン酸化

【研究成果の概要】

細胞質分裂の研究の現状と将来の展望を把握するために、国際シンポジウム『細胞質分裂の分子メカニズム』を平成10年1月28日、29日に東京の駒場エミナースで開催した。海外からは細胞質分裂の研究をリードする8名の研究者を招待し、国内からは将来性のある若手を中心に13名の研究者を招いた。海外から招待した研究者は以下のとおりである。
Kathryn G.Miller (ワシントン大学)
John R.Pringle (ノースカロライナ大学)
Viesturs Simanis (スイスがん研究所)
Fred Chang (コロンビア大学)
Raymond Rappaport (マウントデザートアイランド生物学研究所)
Douglas J.Fishkind (ノートルダム大学)
Arturo DeLozanne (デューク大学)
Yu-li Wang (ウースター生物学医学研究所)
本シンポジウムは国内外の研究者の情報交換や協同研究の打ち合わせの場として有効に機能した。また本シンポジウムの発表から馬渕一誠が代表者として企画された重点領域研究『細胞質分裂の分子機構』に参加した若手研究者が優れた研究成果を上げていること、我が国の細胞質分裂に関する研究が国際的なレベルに達していることなどが確認された。シンポジウム後の研究班会議で、これらの成果を土台として、細胞質分裂の研究の新しい研究組織を企画し、この分野のさらなる発展をめざすことが決定された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997

【配分額】2,700千円 (直接経費: 2,700千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】04402053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋収縮 / メカノケミカルカップリング / 筋原線維 / In vitro滑り運動系 / 顕微画像解析 / レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / 分子モーター / in vitro 滑り運動系 / in vitro滑り運動系 / アクチン / ミオシン

【研究成果の概要】

1.単一筋原線維の構造・力学特性と化学反応とを光学顕微鏡下で位相差像あるいは蛍光像として同時画像化し、解析することのできる顕微操作・顕微解析装置を製作した。この装置は、2波長蛍光励起装置、倒立顕微鏡、顕微鏡操作装置、蛍光用特殊フィルター・ミラー、double-View (W)光学系、超高感度テレビカメラ、ビデオ、画像処理コンピュータからなる。
2.アクチンフィラメントに特異的に結合し、しかもpH感受性を持つ蛍光物質SNAFL-Phalloidin (SF-Ph)を合成し、これを用いて筋原線維を染色し、ATPase活性に伴うpHの減少を画像として捉えた。しかしSF-Phは2波長励起・1波長検出に適しており、W光学系を活用できないので時間分解能は高々1s程度であった。そこで、1波長励起・2波長検出に適し真の意味で同時画像化が可能なW光学系を活用できるSNARF-Ph (SR-Ph)を特注したので、現在研究を進めている。
3.直径1μm程度のプラスチックビーズを70pNの力で捕捉し、顕微操作することのできるレーザー光ピンセット装置(赤外YLFレーザー(1W)、赤外光導入用に特注改造した倒立顕微鏡からなる)を組み上げた。
4.in vitro滑り運動系において、低濃度のATP存在下でアクチンフィラメントに発生する滑り力と1個のATP分子の分解に伴うステップサイズとを光ピンセットを用いて顕微計測した。滑り力は最大捕捉力の下で約3pNであり、ステップサイズは約10nmであった。一方、ATP非存在(硬直条件)下でのアクチンフィラメントと一個のミオシン(HMM)分子との間の硬直結合の破断力を計測し、平均9.2pNという値をえた。同時に得られた張力-歪み曲線の最大傾斜から求めたHMM分子の弾性率は、約0.5pN/nmであった。

【研究種目】一般研究(A)

【研究期間】1992 - 1994

【配分額】44,000千円 (直接経費: 44,000千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】02558026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ケージド化合物 / 急速凍結 / 電子顕微鏡 / アクチン / ミオシン / 液体ヘリウム / エッチング / レプリカ / 急速凍結法 / ケ-ジド化合物 / 光分解 / 時間分解能 / ATP

【研究成果の概要】

ケージド化合物を用いた凍結システムを完成し、このシステムの評価も兼ねて、2種類の実験を行った。第一の実験は、ATP非存在下でアクチンフィラメントにフルデコレーションしたミオシンサブフラグメント1(S1)が、ATP濃度の急激な上昇に伴い、どのようにしてアクチンフィラメントから離れていくかを追跡しようというものである。ケージドATP存在下でS1のアクチンフィラメントへの結合様式があまり変わらないのを確認したのち、このようなサンプルに光を照射し、その後の変化をディープエッチングレプリカ像のコマ取り写真として解析した。その結果、S1が光照射後15ミリ秒あたりからアクチンフィラメントから離脱しはじめ、その結合様式を大きく変えていく様子を初めて捉えることに成功した。得られた像が持つ意味を正確に理解するためには、まだ、多くの実験を進めなくてはならないと思われるが、少なくともこの実験によって、我々の開発したシステムにより、滑り運動系における蛋白質相互作用をきわめて高時間分解能の電子顕微鏡像として追跡できるという確信が得られた。
第二の実験は、無負荷の状態で最高速度で収縮している瞬間の単離筋原線維を急速凍結し、そのクロスブリッジの様子を観察しようとするものである。この収縮は極めて短時間で終わってしまうため、ケージド化合物のシステムを用いる必要がある。現在、光照射後最大収縮速度で短縮中の筋原線維の急速凍結に成功し、そのディープエッチングレプリカ像を得つつある。このような方法により得られる像が筋収縮の分子機構を考えるうえで重要な情報を与えてくれるものと期待出来る。以上、我々が開発したケージド化合物を利用した急速凍結システムは、ほぼ完成しており、このシステムがきわめて強力な研究手段となりうることが証明された。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1991

【配分額】8,800千円 (直接経費: 8,800千円)