Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

シナプス / 神経生理学 / グルタミン酸 / 可塑性 / 超短パルスレーザー

本研究課題では、2光子励起グルタミン酸法を最大限に活用し、生理的刺激下における大脳シナプスの形態と機能の可塑性・安定性を、最も代表的な大脳海馬において定量化する。即ち、細胞の活動電位と2光子励起グルタミン酸法による単一シナプス入力を同期して誘発し、そのタイミングをずらしていくことで、長期増強(LTP)と長期抑圧(LTD)を誘発する。
昨年度の結果で、培養海馬の錐体細胞の活動電位とシナプス後部スパイン刺激の時間間隔を前後にずらすことで、スパイン頭部体積の増大と縮小がそれぞれ起こることがわかったので、本年度はその時間を様々に変えることで、変化量との関係を解析した。その結果、増大化・縮小化とも活動電位のタイミングから50ミリ秒以上ずらすと見られなくなり、10-20ミリ秒の間が最も強く反応が誘発されることがわかった。さらにこの刺激の前後で、スパインにおけるAMPA受容体の反応性が、頭部増大の時には増強し、頭部縮小の時には、抑圧されることがわかった。従って、スパインの構造変化と機能変化は、両方向性において非常に強い相関があることが判明した。これらの反応は、NMDA受容体依存的であった。スパイン頭部体積の増大は、刺激スパイン特異的であったが、スパイン頭部の縮小が起こるときには、時折、刺激以外の周辺スパインにおいても頭部縮小が見られ、ヘテロシナプティックな抑圧が起こっていることが示唆された。現在、論文投稿の準備段階にあり、最終的な実験を行っているところである。

中枢神経細胞 / 神経生理学 / 超短パルスレーザー / ケイジド試薬 / グルタミン酸 / 受容体 / 生理学 / 2光子励起顕微鏡 / スパイン / 高性能レーザー / カルシウム / イメージング

これまでケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。そこで本研究において、可塑性に重要な役割を果たすNMDA受容体の機能と、スパイン形態との間の関係性を調べることを行った。実験方法としては、海馬錐体細胞にホールセルを行い、低親和性カルシウム指示薬と、細胞形態を同定するためのAlexa594をロードした。これはカルシウム指示薬によるカルシウム動態の影響を少なくするためである。細胞外液のマグネシウム濃度を減らした状態で、任意のスパイン部位に対して、2光子励起によってケイジドグルタミン酸を活性化した。その結果誘発される単一スパインにおけるNMDA受容体を介したカルシウム濃度上昇を、2光子励起顕微鏡を用いて、高速ラインスキャンを行ってイメージングした。Alxa594の蛍光に対するカルシウム指示薬の蛍光比によってカルシウム濃度変化を捉えた。この方法によって、一定刺激の条件でのスパイン内カルシウム濃度変化の絶対値を求めることができるようになった。カルシウム濃度上昇は、レーザー出力の2乗に比例し、あるところで飽和することから、スパイン頭部のNMDA受容体を2光子励起法によるグルタミン酸投与によって刺激できることを実証した。また1.5マイクロメートル以上離れたスパイン間では互いに刺激が干渉せず、個々のスパインだけの反応を得られることがわかった。NMDA受容体電流及びカルシウム濃度上昇は、AMPA受容体に比べ、ノイズが高いため、同一スパインにおいて3回刺激し、それを平均化することでCVの低い値を得ることができた。