【研究領域課題番号】18K06054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / 哺乳類ミトコンドリア / リボソーム / 新生ペプチド鎖 / ミトコンドリア / タンパク質合成 / ペプチドトンネル / cryoEM

【研究成果の概要】

本研究は、ミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの構造を明らかにし、新生ペプチド鎖とペプチドトンネルの相互作用について知見を得ることを目指すものである。哺乳類ミトコンドリア翻訳系を再構築し、連続プロリン配列を介した翻訳停止を利用して新生ペプチド鎖リボソーム複合体(ribosome-nascentchain complex, RNC)を形成することに成功した(Lee, 2021)。新生ペプチド鎖の長さについて検討したところ、新生ペプチド鎖の長さが約80アミノ酸以上でそのN末端がミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの外に露出することが明らかになった。

【研究の社会的意義】

近年、ミトコンドリアのリボソームや翻訳因子に誤作用して副作用をもたらす薬剤が多く報告されている。また、リボソームのペプチドトンネルは、新生ペプチド鎖のプロセシングや折りたたみ、細胞内輸送などの制御をになう場であり、ペプチドトンネルは多くの抗生物質の結合部位となっている。本研究により、新生ペプチド鎖の配列や長さを制御しながらミトコンドリアのRNCを調製することが可能になった。今後様々なRNCの構造を決定することにより、薬剤デザイン等に有用な知見が得られると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】15KK0250 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / ミトコンドリア / クライオ電子顕微鏡観察 / リボソーム / 分子生物学 / 低温電子顕微鏡

【研究成果の概要】

様々な哺乳類ミトコンドリア翻訳伸長リボソーム複合体のCryoEM構造解析に取組み、渡航期間中にPRE-recycling複合体(mtRRFmt/55S)と POST-recycling複合体(mtRRF/mtEF-G2・GDPNP/39S)の構造を高分解能で決定した。ミトコンドリアにおけるリボソームリサイクリングの分子機構、リサイクリングとトランスロケーションにおけるEF-Gの作用機序、等の知見が得られた。ミトコンドリアリボソームと翻訳因子の複合体の構造について世界で初めての報告であり、薬剤デザインなどの医療応用にも直ちに結びつく成果である。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化)

【研究期間】2015 - 2017

【配分額】12,220千円 (直接経費: 9,400千円、間接経費: 2,820千円)

【研究分野】寄生虫学(含衛生動物学)

【研究領域課題番号】19590425 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

寄生虫 / ミトコンドリア / タンパク質合成系 / tRNA / EF-Tu / 線形動物 / 節足動物 / 寄生性線虫 / リボソーム / EF-G

【研究成果の概要】

動物ミトコンドリア(mt)のタンパク質合成系は、より短い機能性RNAを用いる。我々は、短縮化したmt tRNA を持つ種と持たない種が混在する節足動物で、短縮化したtRNAを持たない昆虫の2つのEF-Tu のうちの1つが、短縮化したtRNA と結合できることを示した。また、植物寄生性線虫ミトコンドリアで遺伝子が未同定だったtRNA のうち1種の発現を同定した。このtRNA は発現が確認された中で最も短い。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】寄生虫学(含衛生動物学)

【研究領域課題番号】17590368 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

寄生性線虫 / ミトコンドリア / タンパク質合成 / 機能性RNA / リボソーム / tRNA / EF-Tu / 線虫

【研究成果の概要】

多細胞動物のミトコンドリアのタンパク質合成系は、様々な点で真核生物の細胞質や原核生物のタンパク質合成系と異なる特徴を持つ事が明らかになってきた。その中で、線形動物ミトコンドリアのタンパク質合成系は、多細胞生物の中で最短のtRNAセットと最小クラスのリボソームRNAを持つ事が、その遺伝子配列から予測されていた。そこで、タンパク質合成系の機能性RNAが縮小化した際、どのような影響が生じるのかという点が明らかにするため、われわれは寄生性線虫および自由性生活性線虫のミトコンドリアタンパク質合成系を解析してきた。本研究では、これをさらに発展させると共に、このような機能性RNAの縮小化がなぜ起きるのかにも迫った。2年間の主な成果は以下のとおりである。
1.細胞内に微量しか存在すしないミトコンドリアリボソームを、効率よく、高純度に調製するために、タグ付きミトコンドリアリボソームタンパク質を発現する組換え線虫を作製した。この線虫内ではタグつきタンパク質がミトコンドリアに移行し、リボソームに取り込まれていることが示唆された。しかし、現在用いているタグ配列に対するアフィニティ精製では高純度のリボソームを得ることができなかった。複数種のタンパク質とタグ配列の組み合わせを検討する必要があると考えられる。
2.自由生活性線虫Caenorhabditid elegansミトコンドリアEF-Tu2のアミノアシル基特異性をもたらす領域を、高度好熱性細菌のEF-TuにEF-Tu2の配列を移植していくことで明らかにした。
3.旋毛虫ミトコンドリアEF-TuのアミノアシルtRNAに対する結合能を明らかにした。
4.節足動物ミトコンドリアEF-TuのアミノアシルtRNAに対する結合能を明らかにした。
5.新規tRNAメチル基転位酵素候補を同定した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】14208077 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミトコンドリア / tRNA / 翻訳装置 / 最小必須構造 / リボソーム / rRNA / EF-G / L7 / L12蛋白質 / アミノアシルtRNA合成酵素 / X線結晶解析 / 23SrRNA / 16rRNA / 保存配列

【研究成果の概要】

本研究の目標は、翻訳過程における未解決の根本問題を、動物ミトコンドリア(mt)翻訳システムの特殊性を活用して解明することである。それは良く研究されてきた大腸菌の翻訳系をベースにして、それに特殊な動物ミトコンドリアの翻訳装置を組み合わせて行う。
(1)tRNAの最小必須構造:現存する生物の中で最短のtRNAである、線虫mtのセリンtRNA(tRNA^<Ser>_<UCU>:54残基からなり、Dアームはなく、Tアームは3塩基対と4塩基のループからなる)の高次構造をNMRによって検討し、クローバ葉型の2次構造から予測される塩基対は殆ど水溶液中でも存在すること、短縮されたDループとエクストラループからなる連結領域は柔軟な構造をとることが判った。この自由度は、3'末端とアンチコドン間の相対距離を通常のtRNAと同様に保つための調整に不可欠のものである。(2)リボソームの最小必須構造:mtリボソームは大腸菌リボソームに比べ、リボソームRNA(rRNA)が約半減している代わりに、蛋白質が倍増している。rRNAの機能部位は中央部に厳密に保存され、周辺部で欠けたrRNA領域はすべて蛋白質で補填されており、これらRNAの周辺領域に位置するステム・ループ領域がかなり削除可能であることが判明した。
(3)翻訳系のエネルギー源であるGTPの加水分解反応のtriggerは何か:EF-GのGTPase活性がリボソーム蛋白質L7/L12で活性化されることからGTPの加水分解反応のtriggerはL7/L12蛋白質であることが示唆されていたが、我々は、大腸菌EF-Gはmt・リボソームでは機能しないが、EF-GのGTPase活性化因子であるL7/L12蛋白質のみを大腸菌由来のものに置換したmt・リボソームでは機能することを見出し、GTPの加水分解反応のtriggerがL7/L12蛋白質中に存在することを突き止めた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】48,880千円 (直接経費: 37,600千円、間接経費: 11,280千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】11308024 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳システム / ミトコンドリア / EF-Tu / tRNA / セリルtRNAシンテターゼ / 線虫 / リボソーム / X線解析 / in vitro翻訳システム / tRNA^<Ser>GCU / tRNA^<Ser>UGA / セリルtRNAシンテータゼ / X線構造解析 / 機能構造 / ミトコンドリアtRNA / トランスホルミラーゼ / リボソーム蛋白質 / X線結晶解析 / SerRS / 異常構造 / リボソームタンパク質

【研究成果の概要】

本研究の目標は、現存する生物のうちでもっとも単純と思われる、動物ミトコンドリアの特異な翻訳システムにおける個々の装置の機能特性と構造的な異常性に焦点を当て、それらの機能構造の詳細な解析と実行可能なものからその立体構造を解明し、機能発現に必要な構造を探ることをにより、ミトコンドリア翻訳システムの構築原理を解明することである。主たる研究成果は以下の通りである。(1)ウシ・ミトコンドリアのin vitro翻訳システムを構築し、系の最適化を計った結果、ポリ(U)依存ポリ(Phe)合成で大腸菌のものと比肩し得る活性を示す系を確立した。(2)tRNAと翻訳因子をセットにする限り、またL7/L12蛋白質のみ大腸菌由来のものを使う限り、大腸菌とミトコンドリア・リボソームに互換性があるので、本質的にリボソーム機能は両者で等価である。(3)異常な2次構造をもつ2種類のセリンtRNAが低いながらも翻訳機能をもつことを実証した。特に片腕を欠くtRNAの効率の低さはA部位への結合に欠陥のあるためであった。(4)これら2種類のセリンtRNAは単一のセリルtRNAシンテターゼ(SeRRS)でアミノアシル化されることを明らかにし、その認識部位を特定した。(5)線虫ミトコンドリアに存在する大部分のTアーム欠損tRNAを認識する特殊なEF-Tuを発見した。それはC末端に57アミノ酸の延長部をもち、それが欠けたTアーム部分を補完していた。また2種類のDアーム欠損セリンtRNAに対応する別のEF-Tuはアミノ酸部分をも認識していた。(6)これらの翻訳因子の結晶化を行い、SerRSでは針状結晶を得た。tRNA-EF-Tu複合体の結晶化とともに、これらのX線解析を行う。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】34,720千円 (直接経費: 32,800千円、間接経費: 1,920千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】10044196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / リボソームRNA / リボソーム蛋白質 / ミトコンドリア / タンパク質生合成 / LC / MS / ClNA / RNA-タンパク質間の役割委譲 / tRNA / リボソームタンパク質 / RNA・タンパク間の役割委譲 / トランスロケーション / ピリジン / 試験管内再構成法 / FPLC

【研究成果の概要】

本研究はリボソームとリボソームRNA(rRNA)の機能構造を解析することにより、生命体の最も基本的なシステムである翻訳系が如何に機能し、如何に構成されているかの根本原理を解明し、ひいてはそれが如何に生じたかを推論するための基礎的な知見を得ることを目的に立案されたものである。
最初は大腸菌リボソームとrRNAの機能構造を解析するため、大腸菌リボソームをピリジンで処理し、部分的に蛋白質の剥稚したリボソームを用いて翻訳反応の素過程を探る研究を行なった。その結果、ピリジン存在下でも非酵素的(自発的)な転位反応が起り得ることが分かった。
しかし一昨年当たりからリボソームそのものの結晶のX線構造解析が有用なデータを提供し始め、リボソーム上の翻訳反応の素過程もこの原子レベルの高次構造からあらかた推定可能なことが判明したため、研究のターゲットを哺乳動物ミトコンドリアに移し、初期の目的の達成を目指すことにした。このミトコンドリア・リボソーム(ミトリボソーム)は大腸菌のものと比較して、RNAが約半分に短縮されている代わりに、蛋白質が肥大化し、全体として分子量、サイズとも同程度になっているという特徴がある。翻訳機能を担うRNAが短縮しているため、機能部位の同定が容易であり、かつ短縮したRNAに結合する蛋白質は肥大化しているため、RNAから蛋白質への構造的、概能的な役割譲渡の原理解明の可能性がある。現在プロテオーム解析手段を用いて約70種類の蛋白質のうち大腸菌の対応する蛋白質と比較することにより55種類の同定に成功し、そららのcharacterizationを行なっている。またL7/L12蛋白質を大腸菌のもので置き換えたハイブリッド型ミトリボソームは、ミトコンドリアと大腸菌両方のtRNA、翻訳因子を受け入れ翻訳反応を行なうことができる。この互換性の由来をも解明しつつある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】8,500千円 (直接経費: 8,500千円)