Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

筋収縮 / メカノケミカルカップリング / 筋原線維 / In vitro滑り運動系 / 顕微画像解析 / レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / 分子モーター / in vitro 滑り運動系 / in vitro滑り運動系 / アクチン / ミオシン

1.単一筋原線維の構造・力学特性と化学反応とを光学顕微鏡下で位相差像あるいは蛍光像として同時画像化し、解析することのできる顕微操作・顕微解析装置を製作した。この装置は、2波長蛍光励起装置、倒立顕微鏡、顕微鏡操作装置、蛍光用特殊フィルター・ミラー、double-View (W)光学系、超高感度テレビカメラ、ビデオ、画像処理コンピュータからなる。
2.アクチンフィラメントに特異的に結合し、しかもpH感受性を持つ蛍光物質SNAFL-Phalloidin (SF-Ph)を合成し、これを用いて筋原線維を染色し、ATPase活性に伴うpHの減少を画像として捉えた。しかしSF-Phは2波長励起・1波長検出に適しており、W光学系を活用できないので時間分解能は高々1s程度であった。そこで、1波長励起・2波長検出に適し真の意味で同時画像化が可能なW光学系を活用できるSNARF-Ph (SR-Ph)を特注したので、現在研究を進めている。
3.直径1μm程度のプラスチックビーズを70pNの力で捕捉し、顕微操作することのできるレーザー光ピンセット装置(赤外YLFレーザー(1W)、赤外光導入用に特注改造した倒立顕微鏡からなる)を組み上げた。
4.in vitro滑り運動系において、低濃度のATP存在下でアクチンフィラメントに発生する滑り力と1個のATP分子の分解に伴うステップサイズとを光ピンセットを用いて顕微計測した。滑り力は最大捕捉力の下で約3pNであり、ステップサイズは約10nmであった。一方、ATP非存在(硬直条件)下でのアクチンフィラメントと一個のミオシン(HMM)分子との間の硬直結合の破断力を計測し、平均9.2pNという値をえた。同時に得られた張力-歪み曲線の最大傾斜から求めたHMM分子の弾性率は、約0.5pN/nmであった。

筋原線維 / 顕微操作 / 自発的振動収縮 / 筋フィラメント / 筋収縮 / ゲルゾリン / アクチン / βーアクチニン / 収縮系の再構築 / ミオシンフィラメント / アクチンフィラメント / 微量調節タンパク質

今年度の成果の第一は、直径1ー2μmの単一筋原線維や直径数μmの筋原線維束を顕微操作できるようになったことである。総合倍率400ー600倍の倒立位相差顕微鏡下で、液交換できるようにした自作の薄いセルの中で、2本のガラス針に筋原線維の両端を引っかける。ガラス針の一方を細くして、その曲がりの程度から発生張力を見積る。その結果、SPOCとよぶ自発的振動収縮の条件下で、筋原線維が弱いながらも張力を発生し、振動することが分かった。さらに、このようなことが可能になったために、筋フィラメントを精度よく解体できるようになり、しかも再構築が容急になり、同時にその収縮特性をも検討できるようになった。予備実験として、太いフィラメントを両端溶解した後のSPOC(フィラメント長が半分になっても振動する)や、ゲルゾリン処理法によって細いフィラメントを選択除去し、その後精製アクチンを加えて細いフィラメントを再構成した筋原線維の発生張力などを検討した。
ところで、本研究のテ-マの一つである、細いフィラメントの自由(P)端に結合しているはずのβーアクチニンについては、その発見者の丸山工作氏(千葉大、理)自身によって、P端ではなくB端キャップである可能性が強く示唆されたことによって、現在ほとんど白紙に近い状態になってしまった。つまりこれまでβーアクタニンといわれてきた35kDと31kDの2量体は、B端キャップであるということである。しかし我々は既に、独自の方法で、少なくとP端キャップが存在することを示している。また我々は、ゲルゾリン処理法によって細いフィラメントの自由端を単離し、この分画に35kDと31kDの成分がほぼ等量存在することを確認した。(船津等)が、P端キャップの同定のためには、今まで以上により詳細な検討が必要であることが判明した。