【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】21570131 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞情報伝達機構 / 出芽酵母 / 高浸透圧 / リン酸化 / HOG経路 / 擬菌系経路 / 蛋白質相互作用 / グルコース / MAPキナーゼ / ストレス応答 / 酵母

【研究成果の概要】

絶えず変化する生活環境に迅速に適応するため、生物はストレス応答MAPK情報伝達経路(SAPK経路)を備えている。酵母のSAPK 経路である、高浸透圧応答性のHOG経路、貧栄養条件に応答する擬菌糸経路の活性化には、Ste11 MAPKKKの膜移行が必須である。この膜移行にはSte11結合蛋白質のSte50が膜蛋白質のOpy2と結合する必要があるが、Opy2が2つの主要な結合部位(CR-A,B)と弱い結合部位(CR-D)をもつことがわかった。CR-AはSte50と恒常的に結合し、HOG経路及び擬菌糸経路の両方にシグナルを伝達できる。一方、CR-Bはグルコースに富んだ栄養環境においてYck1/Yck2によりリン酸化をうけた場合のみ、Ste50と結合し、HOG経路に優先的にシグナルを伝達する。また、HOG経路や接合経路が活性化されるとSte50は各経路のMAPキナーゼによりリン酸化をうけ、結合したOpy2から解離することを見いだした。これにより、HOG経路の過剰な活性化を抑制し、接合経路の基底状態の活性を低く維持することが可能になる。以上のように、Ste50とOpy2の結合の動的制御がMAPK経路のシグナルネットワークを微調整するのに重要な働きをすることが本研究で明らかになった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)

【研究分野】動物生理・代謝

【研究領域課題番号】14104003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

松果体 / 視交叉上核 / 光受容分子 / エクソロドプシン / G蛋白質 / MAPK / 末梢時計 / E4BP4 / 概日時計 / CREB / ゼブラフィッシュ / Per / グルコース / TIEG1 / Bmal1 / サーカディアンリズム / クリプトクローム / リン酸化 / GSK-3β / 視細胞 / ファルネシル化 / 明順応 / MAPキナーゼ / 転写調節 / カゼインキナーゼ1 / p38キナーゼ / カルシウム結合蛋白質 / BMAL1 / G11

【研究成果の概要】

(1)ニワトリ松果体G11の光活性化が概日時計の位相シフトを導くことを見出した。また、ピノプシン遺伝子の光依存的転写調節に必須の光応答エレメントを同定した。
(2)網膜桿体のG蛋白質のファルネシル化が、光情報伝達だけでなく明順応に重要な役割を果たす事を示した。一方、ゼブラフィッシュ網膜の錐体の光受容体キナーゼGRK7-1は桿体GRK1Aの数十倍も高い活性を示した。
(3)ニワトリ松果体やカエル網膜のMAPK活性が夜にピークを持つ概日リズムを示した。一方、マウス視交叉上核では、MAPKの活性化の時刻と光刺激に対する応答パターンが背内側部と中心部において互いに異なる事を示した。時計システムにおいてMAPKによってリン酸化されるBMAL1、CRY1およびCRY2のリン酸化部位とリン酸化に伴う活性変化を同定した。また、SCOPがK-Rasを介してMAPKを制御することを見出した。一方、ニワトリ松果体においてp38キナーゼ/MAPKAPK2経路が昼に時計発振系に入力して位相前進を導く可能性を示した。
(4)ニワトリ松果体では明期の延長によりE4BP4の発現レベルが高く維持され、Per2の転写抑制を介して位相後退を引き起した。E4BP4はCKIεによってリン酸化され、プロテアソームを介して分解された。
(5)末梢時計モデルとしてrat-1細胞をグルコース刺激すると概日リズムがリセットされることを見出し、その際、時計遺伝子の発現を調節する分子の候補としてTieg1とVdup1遺伝子を同定した。TIEG1はグルコース投与によって発現量が急上昇し、Bmal1プロモーターに直接作用して転写を抑制した。
(6)ゼブラフィッシュ松果体の光受容分子エクソロドプシンの松果体特異的な遺伝子発現を担う新規配列PIPEを同定した。酵母のone-hybrid系を用いたスクリーニングにより複数のPIPE結合因子候補を同定した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2002 - 2006

【配分額】111,930千円 (直接経費: 86,100千円、間接経費: 25,830千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】13780548 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

浸透圧 / グルコース / アクチン / 翻訳 / ストレス / タンパク質合成 / 翻訳開始 / MAPキナーゼ / HOG1

【研究成果の概要】

浸透圧ストレスは出芽酵母の翻訳開始を一過的に停止させ、アクチン骨格も一過的に脱極性化する。申請者は培地からのグルコース除去も翻訳開始の急速な停止だけでなくアクチン骨格の急速な脱極性化を引き起こすが、それらの反応も一過的である事実を見い出した。これは翻訳開始とアクチン骨格の両者が環境ストレスにより同時に制御される機構の存在を示している。この制御機構を明らかにするため、グルコースによるアクチン骨格の極性と翻訳開始の挙動を解析した。
グルコースによる遺伝子の転写抑制に必要なA-キナーゼの変異株(tpk1w)やGlc7ホスファターゼの制御サブユニットの破壊株(reg1)では、グルコース除去後の急速な翻訳開始の停止やアクチン骨格の脱極性化は起こらなかった。またアンチマイシンAにより呼吸を阻害した野生型株、グルコースによる転写の脱抑制に必要なSnf1キナーゼやMsn2/4転写因子の遺伝子破壊株では、グルコース除去後の急速なアクチン骨格の脱極性化や翻訳開始の停止は起こるが、その後の再極性化や翻訳再開は起こらなかった。しかし呼吸阻害条件下でもグルコース飢餓細胞にグルコースを再添加するとアクチン骨格の急速な再極性化が起こった。グルコース再添加による細胞内cAMPの一過的上昇が起こらないGpr1グルコースレセプターやGpa2 GTPaseの遺伝子破壊株でも、この再極性化は正常に起こることから、cAMPの一過的上昇はこの反応には関係ない。従ってグルコースによるアクチン極性と翻訳開始の制御は、(1)A-キナーゼやReg1が関与するグルコース除去後の急速な停止、(2)呼吸、またSnf1やMsn2/4に依存したグルコース非存在下での適応、(3)呼吸やcAMPの一過的上昇に依存しないグルコース再添加による急速な回復、の3つの反応に分類され、転写と共に統括的に制御されていると考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】800千円 (直接経費: 800千円)

【研究分野】動物生理・代謝

【研究領域課題番号】13740478 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

松果体 / ニワトリ / ヒートショックタンパク質 / サーカディアンリズム / グルコース / 時計遺伝子 / 光受容 / 転写因子 / 概日リズム / 転写抑制 / MAPキナーゼ / リン酸化

【研究成果の概要】

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。
1.動物における光依存的転写調節に関わる遺伝子配列(光応答エレメント)は未だ同定されていない。そこで、初年度にひき続き、光に応答するピノプシン遺伝子のプロモータに着目し、ニワトリ松果体細胞を用いた転写アッセイによる解析を行った。その結果、18塩基からなる光応答エレメントを同定することに成功した。このエレメントには時刻情報の入力配列であるCACGTG型のE-box配列が含まれていたことから、松果体をはじめとする動物の光感受性時計細胞においては、光情報と時刻情報がE-box配列において統合されている可能性が強く示唆された。さらに、ゲルシフト解析の結果、この光応答エレメントに作用する因子は、肝臓等の種々の臓器に発現する転写抑制因子であることがわかった。光応答エレメントの解析と並行して、ニワトリ松果体において光応答するピノプシン以外の遺伝子を探索した結果、Hsp90遺伝子の転写が光刺激により顕著に増大することが判明した。
2.新規時計関連分子の同定を目指して、時計発信系を内包するモデル培養細胞(rat-1細胞)を用い、時計遺伝子のリズム発現に関わる因子を探索した。その結果、rat-1細胞をグルコースにより刺激することによって、Per1をはじめとする時計遺伝子の発現量が一過的に減少し、それに続いて概日リズムを示すことを発見した。さらに、種々の薬剤を用いた解析の結果、グルコースによるリズム誘導減少には新たな遺伝子の転写が関与していることが示唆された。そこで次に、グルコースによるリズム誘導の分子メカニズムを知るための手がかりを得るために、マイクロアレイ解析によりグルコース応答遺伝子を検索した。その結果、時計遺伝子の発現を制御する分子の候補としてVdupおよびTieg1遺伝子を同定することができた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)