【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】16370081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA複製 / DnaA / 細胞周期 / DNAポリメラーゼ / タンパク質複合体 / タンパク質機能構造解析 / ATP / プロテオミクス / DnaAタンパク質 / 大腸菌 / 抗菌剤 / タンパク質構造解析 / タンパク質機能解析 / タンパク質相互作用

【研究成果の概要】

DnaA蛋白質は複製起点と複製開始複合体を形成して2重鎖DNAの開裂という開始反応を遂行するほか、複製開始制御機構の標的因子ともなっている。本計画研究では、複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、「DnaAが直接関わる、動的かっ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解する」ことを目指した。
1.全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明
まず、超好熱菌DnaA蛋白質を精製して、機能解析した。大腸菌以外では初めてとなるin vitro複製開始再構成系を構築することに成功した。さらにこのDnaAを用い複製開始複合体の結晶作成を進めた。また、大腸菌DnaAのN末ドメインの機能構造解析を進め、DnaA-DnaA相互作用機構とDnaBヘリカーゼ装着機構を解明した。また、DnaAのATP複合体形成動態解析を進め、新たな機能構造を解明した。
2.DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関
Hda機能解析を進め、Hdaの複合体形成との機能構想相関を見いだした。クランプの機能構造解析を進め、Hdaとの相互作用機構を検討した。さらに、新規のクランプ結合因子の機能解析を進めた。さらにDnaA相互作用因子の探索をプロテオミクス手法で行い、多種の因子を同定し、機能解析を進めた。
3.新規DnaA相互作用因子の機能構造解析:DnaA-DiaA複合体の機能解析
多種のDiaA変異体を分離し機能構造相関解析を進めた。DiaAの結晶構造解明に成功した。DnaA-DiaA複合体が複製開始複合体の形成促進を行うことを初めて解明した。
4.蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発
DnaAドメインIVを結合標的とした化学修飾オリゴヌクレズチドを設計し、合成に成功した。これを用いて結合様式などの解析を進めた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】13,500千円 (直接経費: 13,500千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】13558090 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA複製 / 細胞周期 / DnaAタンパク質 / 大腸菌 / DNAポリメラーゼ / AAA^+ファミリー / ATP / 抗菌剤 / DNA結合 / NMR / X線結晶解析 / AAA+ファミリー / 染色体複製制御

【研究成果の概要】

多剤耐性菌の出現や、新興感染症が次々と発生するなど、新規抗菌剤への社会的需要は高い。DnaA蛋白質は細菌類に広く保存されており、染色体の複製に必須である。DnaA蛋白質(52kDa)のC末端10kDa断片に、この特異的DNA結合能が担われていて、ドメインIVと呼ばれる。DnaA機能阻害剤開発のため、本研究計画前半では、このドメインIV蛋白断片を用いて、活性スクリーニング系の開発、3次元構造解析をまず目指すことにしている。実際、大量生産株を作成し、このドメインのみからなる蛋白断片の精製に成功し、かつ、このドメインIV蛋白には、特異的DNA結合能があることを証明した。さらに初めて、NMRによる構造解析を行い、DnaAドメインIVの^1H,^<13>C,^<15>Nの化学シフトを同定し各アミノ酸残基の帰属も決定した。この成果に基づき、DnaAドメインIVの溶液中での2次構造の決定に成功した。さらに並行して、X線結晶解析による構造解析を行うため、この蛋白ドメインとDNAとの複合体の結晶化を進めて、共結晶の2.5Å解像度での放射光回折データを得、さらに、重元素置換型結晶解析と構造計算を進め、3次元構造を解くことに成功した。この成果により、DnaAタンパク質とDNAとの相互作用機構が分子原子レベルで解明された。以上のような研究進展にあわせて、阻害剤のスクリーニングを行い、新規薬剤候補となる分子を見出した。以上のことから、本研究ではDnaAドメインIVの機能構造解析に基づき理論的に薬剤を選別し、新規抗菌剤の開発研究へと展開するシステムの確立に成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】11,200千円 (直接経費: 11,200千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】11480202 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大腸菌 / DNA複製開始 / DnaA / ATP / ATPase / RIDA / 複製フォーク / リン脂質 / DnaA蛋白質 / DNA複製 / 複製開始制御 / DNAポリメラーゼ / 抗菌剤

【研究成果の概要】

本研究は、大腸菌のDNA複製開始蛋白DnaAの活性制御機構を明らかにすることにより、DNA複製の制御機構を理解することを目的としたものである。すでに研究代表者らは、DnaA蛋白がATPに対して高い親和性を有すること、ATP結合型DnaA蛋白は、それ自身のATPase活性により、不活性なADP結合型となること、及び、複製酵素であるDNAポリメラーゼIIIホロ酵素がDnaA蛋白に結合したATPの加水分解を促進することを明らかにしてきた。本研究では、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素以外のDnaA蛋白のATPaseを促進する因子の検索と精製を試みた。これを実行するために、^<32>Pで放射標識した細胞から、抗体を用いてDnaA蛋白を回収し、細胞内でDnaA蛋白に結合したアデニンヌクレオチドを分析する方法を確立した。さらに、様々なDNA複製の温度感受性変異株を用いた実験により、複製のフォーク進行に関わる蛋白が細胞内でのこの反応に預かることを明らにした。また、試験管内でのDnaA蛋白のATPase活性促進因子として、すでに研究代表者らがRIDAと命名していた分画についても、精製することに成功した。さらに、本研究では、抗体と共沈した放射標識されたリン脂質を分析することにより、細胞内でDnaA蛋白に結合しているリン脂質を明らかにする方法を確立した。その結果、すでに試験管内でDnaA蛋白質を活性化することを研究代表者らが示しているカルジオリピン及びフォスファチジルグリセロールが、抗原抗体複合体として回収されることが示された。この結果は、細胞内でDNA複製開始蛋白DnaAが酸性リン脂質と結合していることを直接示す初めての例である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】15,300千円 (直接経費: 15,300千円)