【研究領域課題番号】20K09780 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

涙腺 / ドライアイ / 再生医療 / 細胞外小胞 / シグナル伝達 / エキソソーム / 再生医学

【研究成果の概要】

涙腺は涙液を眼表面に分泌することで眼表面上皮の恒常性を維持する。涙液中には水分だけでなく、涙液タンパク、電解質、サイトサインなどの液性因子を含む。涙腺機能の障害による涙液量の低下は、涙液水分、液性因子の不足を引き起こし、ドライアイなどの眼表面上皮障害の原因となる。涙腺機能障害に対して、既存の涙液補充療法に加え、再生医療による涙液機能再生が試みられている。
これまで涙腺再生医療の実現に向けて、上皮幹細胞、間葉幹細胞を用いた三次元涙腺再生の手法の開発が求められており、マウス胎生期細胞を用いた技術開発が進んでいる。再生涙腺は、マウスへの移植により生着し、涙腺分泌能の改善を認めるなどの進展を見せる一方、今後の臨床応用には再生涙腺機能に対する新規バリデーション手法を確立し、再生涙腺移植の効果判定や安全性を判別することが求められる。
本研究では、三次元涙腺再生医療の進展を目指して、涙腺再生手法とその新規バリデーション手法の確立を目指して、今期、涙腺における液性因子のひとつである細胞外小胞の存在とその役割について解析をした。マウスより麻酔下において涙液を採取し、超遠心法にて細胞外小胞を分離し、電子顕微鏡下にて観察を行った。また、ウェスタンブロッティング法にて細胞外小胞マーカーの発現を確認した。さらに、マウス培養角膜上皮細胞に細胞外小胞を添加し培養したところ、角膜上皮細胞において恒常性にかかわる可能性が示唆された。
次年度においては、継続し涙腺より分泌される涙液の機能解析を進め、将来の涙腺再生医療における新しい涙腺機能のバリデーション手法の確立を目指す。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】口腔科学およびその関連分野

【研究領域課題番号】17K19746 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 再生医学 / 発生・分化 / 細胞周期 / エクソソーム

【研究成果の概要】

本研究は、エクソソームを介した細胞間情報伝達機構と細胞周期制御機構に着目して、破骨細胞ならびに骨芽細胞分化を統合的に制御する分子、すなわち、「新規骨代謝カップリング因子」の探索を行い、骨代謝メカニズムの理解を深めるとともに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として企画された。
前年度までの研究と同様に、マウス由来骨芽細胞と同破骨細胞を用いて、エクソソームを介した破骨細胞・骨芽細胞間情報伝達機構の存在確認と細胞周期制御ならびに細胞分化への関与を検討した。前年度の実験条件をさらに細かく変更し、骨芽細胞については、通常培養と各分化段階（初期分化段階、中期分化段階、最終分化段階）の細胞からエクソソームを抽出した。また、破骨細胞については、破骨細胞前駆細胞通常培養、分化誘導直後、最終分化後、の各培養条件で培養した細胞からエクソソームを抽出した。骨芽細胞由来のエクソソームを各分化段階の破骨細胞へ、破骨細胞由来のエクソソームを各分化段階の骨芽細胞へ、それぞれ導入し、その後エクソソーム導入が細胞に与える影響を評価した。具体的な評価手法としては、導入細胞における各種分化マーカーの発現と細胞周期制御分子の発現を定量RT-PCRで解析することに加え、形態的な変化も観察した。このように、前年度までの実験結果を参考に、さらにエクソソームのサンプリング時期とその導入時期、細胞培養期間の組み合わせを変えることによってエクソソームを介した骨芽細胞・破骨細胞間情報伝達機構の存在を探った。しかしながら、明確にエクソソームを介した骨芽細胞・破骨細胞間情報伝達機構の存在を示す結果は得られなかった。そのため、網羅的な解析手法を用いて骨芽細胞由来のエクソソームに含まれるマイクロRNAで候補分子となるものを検索開始した。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2017-06-30 - 2023-03-31

【配分額】6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】16H05538 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

micro RNA / 細胞周期 / 骨代謝 / 発生・分化 / 再生医学 / microRNA / シグナル伝達 / 骨代謝学 / 細胞分化

【研究成果の概要】

研究課題

【研究の社会的意義】

本研究によって、Cdk6によって制御されるとともに骨代謝において重要な機能を果たす複数のmicroRNAと、それらのmicroRNAのターゲット分子が同定された。これらの研究成果は過去に報告のない新たな知見であり、今回同定されたmicroRNAとターゲット分子に関して詳細な解析を行うことによって、現時点では治療法が見つかっていない骨系統疾患や難治性骨折などの新規治療法開発に繋がる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13F03750 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / 肝臓 / 発がん / 胆管 / 組織幹細胞 / 再生 / 幹/前駆細胞 / ニッチ / 細胞間相互作用 / シグナル / 線維化 / 肝がん

【研究成果の概要】

重篤な、あるいは、慢性的な障害を受けた肝臓では、未分化性を有する特殊な肝前駆細胞（LPC）が活性化して組織の再生に寄与している。LPCは、肝線維化や肝がん等の病態に関連することが長らく指摘されているものの、その実態や機序は未解明である。本研究課題では、LPCと、これの制御に関わるニッチとの相互作用に注目して、両者の性状・制御機構および肝臓の病態における役割の一端を明らかにすることを目的とした。
前年度までに、脂肪肝・線維化・LPCの誘導（胆管増生）を経て早期に肝がん発症にいたる肝病態モデルマウスを確立した。また、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いて、成体マウス肝臓の肝細胞をはじめとする各種構成細胞に遺伝子導入する系の構築を行った。平成27年度には、これらの実験系と、Cre-loxPシステムを用いた細胞系譜追跡系を組み合わせることで、肝がん細胞の起源・LPCの肝がんへの寄与を解析する実験を行った。その結果、上記肝発がんモデルにおいて形成される腫瘍の大部分は、肝細胞に由来することを明らかにした。一方で、腫瘍形成に先立つ段階において、肝細胞由来のLPCが出現することを示唆するデータも得られた。このような「肝細胞由来のLPC」が肝がんの起源となる可能性について、引き続き詳細な解析を進めている。
また、上述したAAVベクターによる遺伝子導入系を改変することで、マウスの胆管上皮組織での遺伝子操作を可能とする、新たな遺伝子導入系の構築に成功した。その効率および細胞種特異性を、さらに改善するための工夫・検討を行っている。
以上２点の研究成果について、国際誌にて発表するための準備を進めている。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】生体生命情報学

【研究領域課題番号】24240045 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体生命情報学 / シグナル伝達 / 再生医学 / 生物物理 / 神経科学 / 細胞内Mgイオン / パーキンソン病 / 細胞内Caイオン / 興奮電位 / iPS細胞 / 螢光イメージング / 細胞死 / バイオイメージング / 蛍光プローブ / 細胞内Mgイオン動態 / ミトコンドリア / Ｍｇ動員 / GABA / リン酸化酵素 / 新規Mgプローブ / FRET / 一酸化窒素（NO）

【研究成果の概要】

(1)細胞内の特定器官に局在する新規Mgプローブを開発し、ミトコンドリアから細胞質に放出されるMgイオン動態を解析した。(2)一酸化窒素刺激（NO）に伴う細胞内Mgイオン濃度の上昇が、NO/cGMP/KMGシグナル伝達に伴うミトコンドリアからのMgイオン流出によるものであることを示した。(3)パーキンソン病と細胞内Mgとの関係について明らかにすることを目指し、PC12細胞をパーキンソン病様に細胞死させるMPP+（1-methyl- 4-phenylpyridinium ion）で処理した。細胞内Mgイオン濃度と細胞死は強く相関し、MgイオンがMPP+による細胞死を緩和することを突きとめた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】45,760千円 (直接経費: 35,200千円、間接経費: 10,560千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】24590342 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / シグナル伝達 / 肝臓 / 組織幹細胞 / 細胞・組織 / 線維化 / 再生医療

【研究成果の概要】

重篤な障害を受けた肝臓では、未分化性を有する特殊な幹／前駆細胞（肝前駆細胞）が出現して、再生過程に寄与すると考えられている。しかしながら、肝前駆細胞の誘導・増殖・分化を制御する分子機構の詳細や、これと肝線維化や肝がん等の病態との関連の実態や機序は不明である。種々のマウス肝障害モデルを用いた、FGF7を中心とする細胞間相互作用に着目した解析により、肝前駆細胞の動態を制御する新たなシグナル伝達経路や転写因子の存在を明らかにした。また、肝前駆細胞と肝線維化との相互連関の基盤を成すメカニズムの一旦を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】歯科医用工学・再生歯学

【研究領域課題番号】22791938 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオ関連機器 / 再生医学 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / 移植・再生医療

【研究成果の概要】

本研究は、細胞が培養器(CO_2インキュベーター)に合わせるという従来型の概念から、機器が個々の細胞毎に最適化された培養環境を提供するという発想転換に特徴がある。つまり、幹細胞のような細胞特性の維持には、特定の培養条件(酸素濃度)の最適化が重要であり、低酸素が口腔幹細胞維持に必須であることが示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】22790271 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / シグナル伝達 / 肝臓 / 組織幹細胞 / 細胞・組織 / FGF / オーバル細胞

【研究成果の概要】

重篤な障害を受けた肝臓では、未分化性を有する特殊な幹/前駆細胞(オーバル細胞)が出現して、再生過程に寄与すると考えられているが、その詳細は不明であった。マウス肝障害モデルを用いた、細胞間相互作用に注目した種々の解析により、オーバル細胞を支持する新たな細胞種の存在と、この細胞から産生・分泌されてオーバル細胞の出現や増殖・分化の制御に関わるきわめて重要な細胞外シグナル因子を明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】21791004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生 / 循環器 / シグナル伝達 / 発生・分化 / 再生医学 / 循環器・高血圧 / 動物

【研究成果の概要】

イノシトール三リン酸受容体(IP3R)の3種のサブタイプのうち、1型および3型IP3Rを同時に欠損させたダブルノックアウト(1/3DKO)マウスは心臓血管発生異常をきたす。組織マーカーの発現解析と組織特異的1/3DKOマウスの解析により、1型・3型IP3Rは、右心室から心臓流出路の発生において二次心臓領域のうちTbx1非発現領域で機能すると考えられた。さらに、血管内皮細胞に発現する1型・3型IP3Rは、血管発生において血管新生の過程に必須の役割を担うことが示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】19390247 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / シグナル伝達 / 糖尿病

【研究成果の概要】

我々は、PI3K の活性化はβ細胞の機能・増殖に重要であり、その低下が2 型糖尿病におけるインスリン分泌不全に寄与していると仮説を立てた。これを証明するため膵β細胞特異的にPI3K の主要な調節サブユニットの一つであるpik3r1 遺伝子をノックアウトしたマウスβpik3r1KO を、またもう一つの主要な調節サブユニットpik3r2 null マウスとβpik3r1KO を交配させて、β細胞特異的な調節サブユニットの完全ノックアウト(βp85DKO)マウスを作成した。βpik3r1KO マウス、βp85DKO マウスでは、グルコース依存性のインスリン分泌障害のため、高度の耐糖能障害を呈しており、βp85DKO マウスでその障害はより顕著であった。このインスリン分泌の障害として、(1)PI3K の下流であるAkt の活性化の低下によりapoptosisが亢進しており、β細胞量の減少がβp85DKO マウスでは有意に認められた、(2)gap junction形成因子Connexin 36 の発現が有意に低下しており、 通常はグルコース刺激に対して認められるラ氏島全β細胞の同調的インスリン分泌が障害されていた、(3)インスリン分泌顆粒のexocytosis に重要なSNARE 蛋白複合体を形成する分子の発現がcluster として低下していることがcDNA マイクロアレイで確認された。多くの2 型糖尿病患者では、グルコース応答性のインスリン分泌ことに第一相の低下を呈し、周期的同調的インスリン分泌oscillationの低下や、経時的なβ細胞量の低下を伴う。従って、本研究の成果から、インスリンシグナルの下流においてPI3K が膵β細胞の機能や増殖に重要な役割を果たしており、2 型糖尿病ではβ細胞のインスリン抵抗性(インスリンシグナルの低下)が、β細胞の量や機能の低下をもたらして病態を修飾していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】19790740 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生 / 血管 / 咽頭弓 / カルシウム / 発生・分化 / シグナル伝達 / 再生医学 / 循環器・高血圧 / 血管発生 / 咽頭弓発生 / カルシウムシグナル / イノシトール三リン酸受容体 / 遺伝子工学

【研究成果の概要】

小児循環器診療の中で、先天性心疾患に合併して比較的頻度高く認められる大動脈の異常は、咽頭弓・血管系および咽頭弓動脈の発生異常から起因すると考えられる。本研究では、遺伝子改変マウスによる個体レベルでの解析や内皮細胞を用いたin vitroの解析によって、咽頭弓、血管系および咽頭弓動脈の発生に、イノシトール三リン酸受容体を中心とした細胞内シグナルが必須であることが示された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,630千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 330千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】19390509 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医療 / 骨再生 / 人工骨 / 移植・再生医療 / 再生医学 / シグナル伝達 / トランスレーショナルリサーチ / 骨再生療法 / 化合物スクリーニング / 化合物デリバリーシステム / インクジェットプリンター / Colla1GFP / 骨再生インプラント / 三次元造形法 / 骨分化シグナル / siRNA / ナノ送達システム

【研究成果の概要】

本研究の目的は、再生医療の3本柱である「細胞源・足場・シグナル」のうち、シグナル・足場を改善し、細胞移植を補強あるいは代替する新しい骨再生システムを開発することである。次世代型のナノ送達システムと生体材料により、周囲の細胞において骨形成性細胞内シグナルを活性化させることで、細胞を移植することなく骨再生を誘導することに成功した。併せて三次元造形法による患部適合型人工骨の作製法を開発した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)