【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】15100007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョバエ / 遺伝学 / 神経発生 / IAPファミリー / イメージング / キナーゼ / プロテアソーム / 神経細胞死 / ショウジョウバエ / 神経変性 / タンパク質分解 / アポトーシス / JNK / 蛋白質分解 / 神経細胞 / 細胞死 / 発生 / マウス / 細胞選択

【研究成果の概要】

ショウジョウバエ遺伝子の過剰発現スクリーニング(GSスクリーニング)を取り入れることで、神経細胞死シグナルの機能的的ゲノムスクリーニングを行った。ポリグルタミンによる神経細変性に関与する遺伝子として小胞体に存在する不良品蛋白質の輸送チャネル(Sec61α)を同定した。Sec61αは、分泌経路で合成される蛋白質の小胞体への移行と、小胞体関連タンパク質分解Endoplasmic Reticulum Associated Degradation : ERADにおいて小胞体から細胞質への不良品タンパク質の輸送を担う重要なチャネルである。Sec61αをショウジョウバエ複眼や培養細胞で過剰発現すると不良品タンパク質が細胞質に逆輸送されて蓄積し細胞死が誘導されること、逆にSec61αの活性を遺伝学的に弱めることによりポリグルタミン病モデルにおいて細胞質に蓄積していた不良品タンパク質が減少し、晩発性の神経変性が回復することが明らかになった。さらに、GSスクリーニングによって、神経細胞死シグナルを発する候補遺伝子としてDmIKKεが得られた。遺伝子の機能欠損スクリーニングによってもDmIKKεが得られ、細胞死を誘導しないレベルのカスパーゼ活性を調節することを見いだした。細胞死シグナルに関与する遺伝子のスクリーニングからDmIKKεが得られたことをふまえてその基質を探索した結果、種を超えて保存されたカスパーゼ抑制因子DIAP1が同定された。DmIKKεはDIAP1をリン酸化することによってその分解を促進する。DmIKKεを生体でノックダウンすると内在性のDIAP1レベルが組織で上昇した。しかし、この状態でも発生過程での細胞死は正常におこり、ここでのDmIKKεによるDIAP1レベルの調節は細胞死以外の生理機能に関与することが示唆された。本研究が明らかにした段階的なカスパーゼ活性化による神経選択の新たな仕組みは、発生と神経変性での細胞運命決定機構に新たな視点をもたらしたものである。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】119,080千円 (直接経費: 91,600千円、間接経費: 27,480千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】15790654 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JNK / Caspase / p52 / c-Jun / ストレス応答 / アポトーシス / カスパーゼ

【研究成果の概要】

私は、希薄なサンプルを泳動し分解能を上げることにより、放射線によって誘導されるJNKタンパク質をWestern解析により見出した。この放射線によって誘導されるJNKタンパク質(分子量50kDa)は、恒常的に発現している既知のJNKタンパク質(46kDa,54kDa)とは異なる分子量を示すこと、JNKリン酸化特異的抗体によって認識されない非リン酸化型フォームであること、JNKタンパク質の全長を認識するポリクローナル抗体では検出されるが、C端を認識するモノクローナル抗体では検出されないことから、これまで報告のない新しいJNKフォームであることが示唆された。またこの誘導型JNKは、放射線誘発細胞死を起こした細胞で見られることから、細胞死の誘導との関連が示唆された。そこで、アポトーシスにおいて実効的な役割を担うシステインプロテアーゼの1つであるカスパーゼの阻害剤を用いて、p52発現誘導における影響を調べた。その結果、caspase-1,-4の阻害剤であるYVAD-CHOでは、X線照射後のp52発現誘導を抑制できなかったが、caspase-3,7の阻害剤であるDEVD-CHOでは、p52の発現とp54の発現量減少が完全に抑制された。さらにin vitroにおいて、リコンビナンドp54JNK1,P54JNK2はactive caspase-3によって切断されることが判明した。以上の結果からX線や温熱によってアポトーシスを起こす細胞にみられるp52JNKの誘導はp54JNKがカスパーゼによって切断された切断産物である。カスパーゼは哺乳類細胞では、14種類以上存在することがわかっている。先の結果からDEVD-CHOに感受性のあるカスパーゼcaspase-3,-7は基質タンパク質内のDXXDという配列を認識し、基質を切断する。しかしながらp54JNKのアミノ酸配列内にDXXD配列は存在しないことがわかったため、C端側に存在するatypicalな配列であるSDTDという配列に着目した。この配列のP1ポディションのDをAに置換した変異体を構築し、活性型caspase-3と反応させたところ、切断は抑制された。さらに切断型JNK(p52)の細胞内局在と機能をかいせきするため、p52発現ベクターを構築し、ヒト胎児腎細胞(293T)に導入した。その結果、P52の細胞内局在は、既知のJNKと変わらないこと、P52発現による放射線感受性の変化は無いことが判明した。In Vitroの実験でもp52のc-Junリン酸化能に変化は認められなかった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】14370271 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Hyperthermia / Heat sensitization / SAPK / JNK / DNA-PK / wortmannin / p53 / U937 Cells / Cell death / Apoptosis / 温熱 / シグナル伝達 / p53 null / U937細胞 / 細胞死、アポトーシス / 温熱高感受性 / Akt / Wortmannin / リン酸化特異抗体 / 細胞死 / セラミド / 温熱療法

【研究成果の概要】

本申請では、温熱感受性のメカニズム、温熱応答、特に細胞死に至るシグナル伝達と応答遺伝子、タンパク質を明らかにする。そして温熱治療に有用な感受性修飾法の開発を長期目標とする。細胞の生死は、p53経路と別に、細胞の生存・増殖に関わるMAPK(Mitogen activated protein kinase),AKT経路と細胞死に関わるSAPK(Stress activated protein kinase)経路のバランスによって決定されるという仮説について、p53がnullで機能していないが温熱高感受性のU937細胞を用い、以下の解明を行った。
1)温熱応答に至るセカンドメッセンジャー分子、上流のシグナル伝達経路について解明
2)シグナル伝達に続き誘導される遺伝子群や応答タンパクのうち、温熱応答、特に細死感受性に関与する因子
3)温熱細胞死におけるDNA-PKの役割とwortmanninの温熱増感への関与のメカニズム
以上の研究の中で、温熱処理などでアポトーシスを誘導する細胞において、既知分子量とは異なる52kDa(p52)のJNKが誘導されてくること。p52JNKの発現誘導は、p54JNKの発現量減少と関係関係があること、更にp52は、P54JNKのカスパーゼ-3,7による分解産物であることをカスパーゼ阻害剤、p54JNKのアミノ酸置換体により証明した。細胞死に至る経路としてJNKの活性化によりc-Mycが急速に減少し、特異的inhibitorなどでc-Mycの減少を起こすと細胞死が起こることを証明した。wortmanninが示す温熱増感作用のメカニズムに関して、リン酸化部位特異抗体を用いたwestern blottingを中心にした実験やJNKのdominant negative作用をもつ変異細胞を用いた実験等からAKT経路の抑制ではなく、SAPK/JNK経路の活性化の増強によると考えられる結果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】12,800千円 (直接経費: 12,800千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】12480214 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

MST1 / JNK / アポトーシス / Bax / 核凝縮 / MST / カスペース

【研究成果の概要】

ストレスで活性化するMAPキナーゼスーパーファミリーJNK、p38の経路の上流に位置するMST1の機能を検討した。MST1は細胞に発現すると細胞膜のblebbingや核の凝縮を引き起こし、アポトーシス様の形態変化を引き起こす。本研究において、MST1はこれらのアポトーシス様の形態変化をJNKの活性化を介して引き起こしていることを明らかにした。また、MST1はJNKの活性化によりDNAのヌクレオソーム単位の断片化を引き起こすが、これはカスペースの活性化を介していることが明らかになった。一方、核の凝縮と細胞膜のblebbingはカスペース活性を抑制しても誘導された。従って、MST1-JNK経路はカスペース依存的・非依存的両方の経路を介して細胞死を誘導することが示唆された。
MST1は、カスペースの上流に位置するだけでなく、カスペースによって切断されて活性化をされることを我々のグループは以前に報告した。本研究によって、MST1はC末端側に核外移行シグナル(NES)を有しており、NES依存的に細胞質局在を示すこと、またカスペースによる切断によりMST1のNESがキナーゼドメインから離れ、キナーゼドメインの核移行が起こることが明らかになった。さらに、核内に局在することがMST1による核凝縮誘導を促進することも示唆された。従ってMST1が、アポトーシス刺激によって核内移存し、核の凝縮を誘導するメッセンジャーとして働いている可能性が示唆された。
JNK経路がカスペースカスケードを活性化させるメカニズムを検討した。ミトコンドリア経路の場合、Bcl-2ファミリーの制御下でミトコンドリアからシトクロームcが放出され、これがカスペースカスケード活性化の引き金となる。本研究で、細胞死誘導型Bcl-2ファミリーのメンバーであるBaxのミトコンドリアへの移行をJNK経路の活性化によって誘導されることを見いだした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】11558092 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JNK / カスペース / アポトーシス / MAPキナーゼ / 細胞生存 / p38 / MST1 / PI3キナーゼ

【研究成果の概要】

MAPキナーゼが生存促進に働くか否かを小脳顆粒細胞の初代培養系を用いて検討した結果、BDNF(脳由来神経栄養因子)による生存促進に必要であることが明らかになった。BDNFはMAPキナーゼ経路以外にもPI3キナーゼ経路も活性化するがPI3キナーゼ経路も生存促進に必須であることがわかった。PI3キナーゼ-Akt経路は、上記小脳顆粒細胞以外にも広く細胞生存促進シグナルとして機能することが示されてきている。しかしながらAktがいかなるメカニズムで生存を促進するかについては、幾つかAktの基質は報告されているものの全貌は未だ明らかではない。本研究では、Aktが新たに核内受容体型転写因子Nur77をターゲットとすることを見いだした。また我々のグループは以前に、Aktがcytochrome cによるカスペースカスケードの活性化を抑制することを見いだしている。本研究においてAktがカスペース9の2つの部位を特異的にリン酸化し、カスペース9のApaf-1への結合能を抑制していることをはじめて示した。この結果は、Aktがミトコンドリアから下流のアポトーシスシグナルを抑制する分子機構を説明するものである。新たにリン酸化部位が同定されたことから、このリン酸化に相当する阻害機構が、カスペース9のApaf-1へのリクルート・活性化を抑制することが考えられ、アポトーシスの重要なステップの阻害法を考える上で有用な情報が得られたと考えている。今後はこの抑制を模倣する方法を模索する方向で研究を進めたい。本研究ではさらに、MST1-JNK経路が、カスペースの活性化およびカスペースの下流での核凝集・膜変化に関与することが示唆された。このことから更に、MST1-JNKは、カスペース非依存的細胞死経路にも関与することが予想される。実際様々な神経変性疾患のモデル系で、カスペース非依存的細胞死が起こっていることが報告されており、またこの場合多くの系でJNK経路の活性化は起きている。従って、JNKの新しい機能を調べていくことは、これらの系での細胞死を抑制する方法を開発するにあたって手がかりを与えることになると考える。実際我々は今回の結果から、JNKがカスペース非依存的に核凝縮を引き起こすことを示したので、この結果をもとにJNKの核凝縮におけるターゲットの検索を始めている。この研究は、将来的に神経変性疾患などで見られる細胞死の抑制法につながることを期待している。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】11670834 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

表皮 / ケラチノサイト / 分化 / アポトーシス / MAP kinase / ASK1 / JNK / p38 MAP kinase / p38MAP kinase / p38

【研究成果の概要】

ASK1がケラチノサイトのアポトーシスを誘導するかどうか検討した。Ad-1W,Ad-β-gal,をコントロールとしてAd-ASK1-ΔNをMOI5,50で感染させ、形態変化を観察した。24hでは、大きな形態変化はない。48h後には、従来他の細胞で報告されているようにMOI50で、ケラチノサイトはアポトーシスを起こした。TUNEL法にてアポトーシスを確認した。しかし、Ad-ΔN-ASK1のMOI5では、アポトーシスは起こさず細胞が大型化・扁平化し、分化と考えられる形態変化を示した。TUNEL法にても陽性細胞はほとんど見られない。ASK1がケラチノサイトのアポトーシスを起こすことが確認できたが、低いdoseでは分化を起こすことが示唆されるので、次に分化マーカーを調べた。
InvolucrinタンパクはWestern blot法,Transglutaminase-1 mRNAはNorthern blot法にて調べた。MOI5でASK1-ΔNはInvolucrinタンパク、Transglutaminase-1 mRNAを誘導していた。この変化は代表的なケラチノサイトの分化誘導因子である10%FCS含有培養液による誘導と同様である。形態変化とも考え合わせると、MOI5のASK1-ΔNはケラチノサイトの分化を引き起こすと考えられる。
ASK1-ΔNによるケラチノサイトの分化誘導時に、ASK1の下流にあるJNKとp38MAP kinaseの活性が誘導されているかどうか検討した。Ad-ASK1-ΔNをMOI5で感染させ、時間を追って活性を検討したところ、ASK1タンパクの出現パターンとほぼ一致して6-12時間後よりJNKとp38MAP kinaseの活性の上昇が見られたことから、ASK1はケラチノサイトのSEK1-JNKとMKK3/MKK6-p38MAP kinaseのカスケードを活性化していると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】10470396 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ASK1 / JNK / P38 / アポトーシス / p38 / MAPキナーゼ / Traf / Daxx

【研究成果の概要】

アポトーシスのシグナル伝達機構は、最終的な細胞死の実行機構としてのシステインプロテアーゼの解析を中心に研究が進められているが、アポトーシスの誘導シグナルについては不明な点が多い。われわれは、ASK1-MAPキナーゼ系の活性制御機構ならびにASK1誘導性アポトーシスの分子機構の解明を中心に研究を行なった。前年度までの研究成果からASK1活性制御機構の分子機構として、チオレドキシンならびにTRAF2がそれぞれASK1の活性抑制因子ならびに活性化因子として機能していることが明らかになっていた。本年度は両者の相対関係を検討した結果、TNF-TRAF2系によるASK1の活性化機構ではTRAF2とASK1の結合に先行してチオレドキシンの不活化ならびにASK1からの解離が誘導されることが明らかになった。また、ASK1によって誘導されるアポトーシスの過程では、ASK1によって活性化されたJNKによるBcl-2のリン酸化が重要な役割を果たしていることが明らかにされた。さらに構成的活性化型ASK1を用いた実験等により、細胞内でのASK1の活性化はアポトーシスのみならず、ASK1の活性化の程度に応じて細胞分化を誘導しうることが明らかになった。さらにASK1による細胞分化誘導は主にp38が活性化されることによるものであることが示唆された。われわれは本年度の研究成果として、TNFがASK1-MAPキナーゼ系の活性化に至る分子機構を明らかにした。またASK1が強く活性化されるとASK1-JNK系がBcl-2のリン酸化を介してアポトーシスを誘導するのに対し、ASK1-p38系は少なくとも一部の細胞で分化誘導に働くことが明らかになり、分化と死のシグナル伝達の連続性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】12,500千円 (直接経費: 12,500千円)