Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

ウロキナーゼ / アポトーシス / MAPK / 内耳有毛細胞 / らせん神経節細胞 / 内耳障害 / 有毛細胞 / らせん神経節 / Ｐ３８ / アミノ配糖体 / ＭＡＰＫ

ウロキナーゼは血栓溶解薬として臨床応用されている薬剤であるが、近年その抗アポトーシス効果が報告されるようになってきた。今回我々は、ウロキナーゼの内耳アポトーシス予防効果を検討した。内耳有毛細胞培養系にてアミノ配糖体によるアポトーシスをウロキナーゼが予防することを示した。同時にウロキナーゼ投与がアポトーシス経路のP38を活性化することを示しメカニズムの一部を示した。らせん神経節培養系を用い、グルタミン酸投与によるアポトーシスも抑制することも証明した。以上の結果は今後の内耳治療の一つの選択肢として期待できると考える。

JNK / カスペース / アポトーシス / MAPキナーゼ / 細胞生存 / p38 / MST1 / PI3キナーゼ

MAPキナーゼが生存促進に働くか否かを小脳顆粒細胞の初代培養系を用いて検討した結果、BDNF(脳由来神経栄養因子)による生存促進に必要であることが明らかになった。BDNFはMAPキナーゼ経路以外にもPI3キナーゼ経路も活性化するがPI3キナーゼ経路も生存促進に必須であることがわかった。PI3キナーゼ-Akt経路は、上記小脳顆粒細胞以外にも広く細胞生存促進シグナルとして機能することが示されてきている。しかしながらAktがいかなるメカニズムで生存を促進するかについては、幾つかAktの基質は報告されているものの全貌は未だ明らかではない。本研究では、Aktが新たに核内受容体型転写因子Nur77をターゲットとすることを見いだした。また我々のグループは以前に、Aktがcytochrome cによるカスペースカスケードの活性化を抑制することを見いだしている。本研究においてAktがカスペース9の2つの部位を特異的にリン酸化し、カスペース9のApaf-1への結合能を抑制していることをはじめて示した。この結果は、Aktがミトコンドリアから下流のアポトーシスシグナルを抑制する分子機構を説明するものである。新たにリン酸化部位が同定されたことから、このリン酸化に相当する阻害機構が、カスペース9のApaf-1へのリクルート・活性化を抑制することが考えられ、アポトーシスの重要なステップの阻害法を考える上で有用な情報が得られたと考えている。今後はこの抑制を模倣する方法を模索する方向で研究を進めたい。本研究ではさらに、MST1-JNK経路が、カスペースの活性化およびカスペースの下流での核凝集・膜変化に関与することが示唆された。このことから更に、MST1-JNKは、カスペース非依存的細胞死経路にも関与することが予想される。実際様々な神経変性疾患のモデル系で、カスペース非依存的細胞死が起こっていることが報告されており、またこの場合多くの系でJNK経路の活性化は起きている。従って、JNKの新しい機能を調べていくことは、これらの系での細胞死を抑制する方法を開発するにあたって手がかりを与えることになると考える。実際我々は今回の結果から、JNKがカスペース非依存的に核凝縮を引き起こすことを示したので、この結果をもとにJNKの核凝縮におけるターゲットの検索を始めている。この研究は、将来的に神経変性疾患などで見られる細胞死の抑制法につながることを期待している。

表皮 / ケラチノサイト / 分化 / アポトーシス / MAP kinase / ASK1 / JNK / p38 MAP kinase / p38MAP kinase / p38

ASK1がケラチノサイトのアポトーシスを誘導するかどうか検討した。Ad-1W,Ad-β-gal,をコントロールとしてAd-ASK1-ΔNをMOI5,50で感染させ、形態変化を観察した。24hでは、大きな形態変化はない。48h後には、従来他の細胞で報告されているようにMOI50で、ケラチノサイトはアポトーシスを起こした。TUNEL法にてアポトーシスを確認した。しかし、Ad-ΔN-ASK1のMOI5では、アポトーシスは起こさず細胞が大型化・扁平化し、分化と考えられる形態変化を示した。TUNEL法にても陽性細胞はほとんど見られない。ASK1がケラチノサイトのアポトーシスを起こすことが確認できたが、低いdoseでは分化を起こすことが示唆されるので、次に分化マーカーを調べた。
InvolucrinタンパクはWestern blot法,Transglutaminase-1 mRNAはNorthern blot法にて調べた。MOI5でASK1-ΔNはInvolucrinタンパク、Transglutaminase-1 mRNAを誘導していた。この変化は代表的なケラチノサイトの分化誘導因子である10%FCS含有培養液による誘導と同様である。形態変化とも考え合わせると、MOI5のASK1-ΔNはケラチノサイトの分化を引き起こすと考えられる。
ASK1-ΔNによるケラチノサイトの分化誘導時に、ASK1の下流にあるJNKとp38MAP kinaseの活性が誘導されているかどうか検討した。Ad-ASK1-ΔNをMOI5で感染させ、時間を追って活性を検討したところ、ASK1タンパクの出現パターンとほぼ一致して6-12時間後よりJNKとp38MAP kinaseの活性の上昇が見られたことから、ASK1はケラチノサイトのSEK1-JNKとMKK3/MKK6-p38MAP kinaseのカスケードを活性化していると考えられる。

ASK1 / JNK / P38 / アポトーシス / p38 / MAPキナーゼ / Traf / Daxx

アポトーシスのシグナル伝達機構は、最終的な細胞死の実行機構としてのシステインプロテアーゼの解析を中心に研究が進められているが、アポトーシスの誘導シグナルについては不明な点が多い。われわれは、ASK1-MAPキナーゼ系の活性制御機構ならびにASK1誘導性アポトーシスの分子機構の解明を中心に研究を行なった。前年度までの研究成果からASK1活性制御機構の分子機構として、チオレドキシンならびにTRAF2がそれぞれASK1の活性抑制因子ならびに活性化因子として機能していることが明らかになっていた。本年度は両者の相対関係を検討した結果、TNF-TRAF2系によるASK1の活性化機構ではTRAF2とASK1の結合に先行してチオレドキシンの不活化ならびにASK1からの解離が誘導されることが明らかになった。また、ASK1によって誘導されるアポトーシスの過程では、ASK1によって活性化されたJNKによるBcl-2のリン酸化が重要な役割を果たしていることが明らかにされた。さらに構成的活性化型ASK1を用いた実験等により、細胞内でのASK1の活性化はアポトーシスのみならず、ASK1の活性化の程度に応じて細胞分化を誘導しうることが明らかになった。さらにASK1による細胞分化誘導は主にp38が活性化されることによるものであることが示唆された。われわれは本年度の研究成果として、TNFがASK1-MAPキナーゼ系の活性化に至る分子機構を明らかにした。またASK1が強く活性化されるとASK1-JNK系がBcl-2のリン酸化を介してアポトーシスを誘導するのに対し、ASK1-p38系は少なくとも一部の細胞で分化誘導に働くことが明らかになり、分化と死のシグナル伝達の連続性が示唆された。

【研究分担者】
森島義行	第一製薬(株)	創薬第三研究所	研究員

【研究分担者】
白方裕司	愛媛大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
一條秀憲	東京医科歯科大学	歯学部	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
斉藤正夫	東京医科歯科大学	歯学部・日本学術振興会	特別研究員
武田弘資	東京医科歯科大学	歯学部	助手	(Kakenデータベース)