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2021年度は、これまでに最適化した条件（骨欠損サイズ・標識に用いる遺伝子改変マウス：Sox9-CreERT2）において、骨欠損モデルを作製後、一定期間経過後の骨修復部位において細胞を単離し、一細胞RNA-seq解析 (scRNA-seq)を行った。骨修復部位周辺の組織を顕微鏡下で採取後、酵素処理により組織中の細胞を回収した。scRNA-seq解析には10x Genomics社のChromium解析プラットホームを用いた。一細胞ごとに異なる分子バーコード含有ビーズと液滴をマイクロ流路において反応させることで、各細胞に異なる分子バーコードを付加した後、逆転写酵素によりcDNAを合成し、さらにcDNAを増幅しライブラリーを作製した。バイオアナライザーにてライブラリーのサイズを確認した後、次世代シーケンサーを用いたシークエンスを行った。得られたシークエンスデータは東京大学医科学研究所スーパーコンピューターShirokaneを用いて解析した。Cell Rangerソフトウェアを用いてマウスリファレンスゲノムmm10へマッピングした後、Seuratを用いてさらなる解析を行った。正規化、クラスタリングおよび2D可視化解析を行った後、得られた各クラスターのアノテーションを行った。さらにMonocle 3パッケージを用いて、pseudo time（偽時系列）解析により、骨格系前駆細胞から成熟骨芽細胞までの各細胞データセットを連続的に配置することで、骨修復におけるダイナミックな遺伝子発現変化を解析した。その結果、骨修復過程において、骨格系前駆細胞は、成熟骨芽細胞への細胞系譜と、脂肪細胞前駆細胞への細胞系譜の２方向性を有することが明らかになった。

【研究分担者】
大庭伸介	長崎大学	医歯薬学総合研究科(歯学系)	教授	(Kakenデータベース)